Неинвазивные методы диагностики Н.pylori- инфекции

Если говорить о тенденциях в развитии методов диагностики, то в последние годы произошел сдвиг в сторону неинвазивных методов, где достигнут наибольший прогресс.

Уреазный дыхательный тест (УДТ)

Прежде всего, следует сказать, что в развитых странах в последние годы стандартным методом контроля за эрадикацией стал именно этот тест.

Тест основан на способности уреазы разлагать мочевину до НСО₃Ї и NH₄+. Из НСО₃Ї образуется СО₂, который попадая в кровоток затем транспортируется в легкие.

Для проведения УДТ необходима мочевина, меченная радиоактивным углеродом ¹³С или ¹⁴С. Чаще в клинической практике используется нерадиоактивный стабильный углерод ¹³С. ¹⁴С используется реже, так как является источником излучения низко энергетических β-частиц, которые обнаруживаются сцинтиляционным счетчиком.

Изотоп количественно определяют газовым хроматомас-спектрометром или с помощью инфракрасного и лазерного оборудования.

В начале исследования берутся 2 фоновые пробы выдыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат и в течение 1 часа, с интервалом в 15 минут у него берут по 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воздухе определяют в течение 10-30 минут. Затем пробирки направляются на масс-спектрометрию. Результат выражается как приращение ¹³СО₂ – д¹³СО₂, его экскреция (%о) и считается положительным при значениях выше 5%о. В ряде стран используется определение изотопического отношения концентраций ¹³СО₂/¹²СО₂, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных погрешностей.

В развитых странах данный тест считается основным для выявления Helicobacter pylori - инфекции, однако сдерживающими факторами для повсеместного использования этой методики являются стоимость оборудования (масс-спектрометр) и изотопа. Поскольку уменьшение стоимости изотопа невозможно, были предложены варианты масс-спектрометров на основе лазерного и инфракрасного излучения, стоимость которых существенно ниже. С другой стороны, использование микрокапсул для упаковки мочевины, меченной радиоактивным изотопом, позволило свести к минимуму трудности, связанные с хранением, утилизацией и безопасностью данного изотопа. В США продажа микрокапсул с мочевиной, меченной углеродом, разрешена FDA наравне с обычными лекарственными препаратами через аптечную сеть, что является свидетельством полной безопасности данного изотопа для обследуемых и окружающей среды. Появление такой формы меченной мочевины существенно повышает конкурентноспособность этой методики, т.к. стоимость и самого изотопа, и оборудования для его проведения в среднем меньше в 10 раз, чем масс-спектрометра.

Показаниями для проведения УДТ служат: эпидемиологические исследования, скрининг перед эндоскопией и наблюдение за больным после лечения.

Иммунологический метод

Колонизация Н.pylori вызывает системный иммунный ответ. Через 3-4 недели после инфицирования в слизистой оболочке и в крови больных появляются антитела к Н.pylori. Эти антитела определяются путем иммуноферментного анализа. Выявляют антитела IgG, IgA, IgM-классов в крови и секреторные sIgA , sIgM в слюне и желудочном соке.

Поскольку инфекция является хронической и ее спонтанный клиренс невозможен, то положительные серологические тесты у нелеченных пациентов указывают на наличие текущей инфекции. Несмотря на то, что уровень антител в процессе успешной эрадикации падает, серологическая реакция остается положительной в течение ряда лет. Этот “серологический рубец” ограничивает возможности исследования крови для оценки эффективности лечения или для диагностики наличия у больного Н.pylori. Однако быстрое падение уровня антител косвенно может указывать на санацию СОЖ.

Имеется несколько модификаций этого теста: -ELISA- (ферментный иммуносорбентный метод), реакции фиксации комплемента, бактериальной и пассивной гемагглютинации.

Классический иммуноферментный анализ с количественным определением в сыворотке или плазме крови больных антихеликобактерных антител разных классов характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, в пользу чего свидетельствуют сравнительные исследования наборов для проведения таких анализов, выпускаемых различными производителями. Данный метод идеален для первичной диагностики, так как при высокой чувствительности и специфичности (более 90% по сравнению с инвазивными методами, включая ПЦР) он на сегодняшний день самый дешевый. Увеличение чувствительности и специфичности метода, вследствие совершенствования технологии, позволило применить его для диагностики эрадикации, и если 5 лет назад диагностика эрадикации с помощью иммуноферментного анализа была возможна только через 8-12 месяцев после лечения, то для выпускаемых в настоящее время наборов для ИФА этот срок уменьшился до 3 месяцев.

Использование же высокочувствительных наборов, в основу которых положен непрямой ИФА с применением антигена Н.pylori, меченного биотином, позволяет зафиксировать снижение концентрации специфических антител уже через 30-40 дней после окончания успешного лечения, и, таким образом, укладывается в сроки оценки эрадикации, принятые для инвазивных методов и дыхательного теста. Учитывая это обстоятельство, и то, что стоимость такого анализа ненамного выше обычного ИФА, следует признать его весьма перспективным.

ИФА в кале

Безусловной сенсацией 1998 года явилось появление на рынке теста для количественного определения антигена Н.pylori в фекалиях больных с помощью ИФА. Мультицентровое исследование в странах ЕС, проведенное более чем на 400 больных, подтвердило его высокую эффективность в определении эрадикации в сравнении с инвазивными методиками и дыхательным тестом. Более того, полученные данные свидетельствуют, что с помощью этого теста можно мониторировать лечение, то есть прогнозировать эффект антихеликобактерной терапии. Стоимость одного анализа пока остается на уровне дыхательного теста. Тест также зарегистрирован FDA в США.

Иммуноблотинг существенно уступает другим иммунологическим методам как по стоимости, так и по трудоемкости выполнения анализа, однако только с его помощью можно, имея лишь сыворотку крови больного, получить данные о свойствах штамма Н.pylori (продуцирует ли он CagA и VacA).

ПЦР в кале

На конференциях Канадской группы по изучению Helicobacter pylori (CSHPG) в 1999 году и Европейской группы по изучению Helicobacter pylori (ESHPG) в 2000 году были приняты рекомендации по диагностике и лечению Н.pylori-инфекции у детей, в которых указывалось на предпочтительность неинвазивной диагностики этой инфекции, особенно при контроле лечения (P. Sherman, 1999; B. Drumm, 2000). На основании этих рекомендаций в Европе и Америке для диагностики Н.pylori-инфекции в настоящее время используют иммуноферментный анализ (ИФА) для определения антител против H.pylori (серологический метод) и уреазный дыхательный тест с С¹³ меченым атомом углерода ([¹³C]UBT).

Однако, серологический метод на практике оказался малоэффективным для диагностики Н.pylori-инфекции у детей. Так, при первичной диагностике Н.pylori-инфекции у детей в ряде случаев отмечается слабый иммунный ответ, а это, в свою очередь, затрудняет верификацию антител против H.pylori. Из-за медленного снижения титра антител после успешно проведенной противохеликобактерной терапии, которое продолжается в течение 6 месяцев, серологический метод, как оказалось, мало пригоден и при раннем контроле лечения как у детей, так и у взрослых (A. Cutler, 1996).

Несмотря на широкое использование в клинической практике в Европе и Америке уреазного дыхательного теста с С13 меченым атомом углерода он имеет ограничения при использовании его у детей раннего возраста (J. Dominiguez-Munos, 1997). В России этот тест не нашел широкого распространения из-за высокой стоимости оборудования и мочевины с С¹³ меченым атомом углерода.

Несколько лет назад в Европе появился новый неинвазивный тест, на основе ИФА, позволяющий определять антиген H.pylori в кале – Premier Platinum HpSA (Meridian Diagnostics, Италия). Многочисленные мультицентровые исследования, как в нашей стране, так и за рубежом показали высокую чувствительность и специфичность этого теста при первичной диагностике Н.pylori-инфекции и контроле лечения (A. Markristatis, 1998; D. Vaira, 1999; В.М. Говорун, 2000). Этот тест был признан «золотым стандартом» в диагностике Н.pylori-инфекции. Единственным ограничением широкого использования этого теста в клинической практике остается его высокая стоимость по сравнению с другими методами диагностики хеликобактериоза.

Попытки создания альтернативного, более дешевого, неинвазивного метода диагностики Н.pylori-инфекции на основе ПЦР до настоящего времени заканчивались неудачей из-за большого количества ложно-положительных результатов (A. Markristatis, 1998; D. Vaira, 1999; L Trevisani, 1999). Тем не менее, на базе научной лаборатории НПФ «ЛИТЕХ» был разработан новый тест для диагностики Н.pylori- иннфекции в кале на основе ПЦР.

Чувствительность нового неинвазивного метода диагностики Helicobacter pylori–инфекции в кале у взрослых составила 91,1%. Созданная тест-система на основе ПЦР, позволяет верифицировать ДНК H.pylori в кале у детей и взрослых и не уступает по чувствительности и специфичности Premier Platinum HpSA - тесту.

При проведении первой серии экспериментов верификации ДНК H.pylori в кале у взрослых чувствительность созданного нами теста оказалась значительно ниже и составила 75,6%. Нами, в свою очередь, было сделано предположение, что снижение чувствительности ПЦР-теста при первичной диагностике H.pylori-инфекции у взрослых связано, скорее всего, с более длительной эвакуацией каловых масс. Более длительная эвакуация каловых масс у взрослых, по сравнению с детьми, по-видимому, способствовала разрушению ДНК H.pylori. В связи со сделанным предположением, для увеличения скорости эвакуации кала, всем взрослым пациентам накануне исследования в качестве слабительного был назначен Дюфалак (СолвейкФарма, Франция) по 30 мл утром и вечером. После назначения слабительного и сокращения времени эвакуации кала чувствительность ПЦР-метода при первичной диагностике H.pylori–инфекции у взрослых стала такой же, как при первичной диагностике у детей и составила 91,1%.

Использование ПЦР-теста на 4-ой неделе после успешно проведенной противохеликобактерной терапии показало низкую специфичность, созданного нами теста, которая составила – 75,7%.

При проведении контроля лечения на 6-ой неделе нами была отмечена тенденция к снижению количества ложноположительных результатов и специфичность, созданного нами теста составила – 93,9%.

На 8-ой неделе специфичность теста составила 100%. Нами не было получено ни одного ложноположительного результата.

В 1999 г L. Trevisani и соавт. в 2000 г R. Ohkura и соавт. также обратили внимание на высокий процент ложноположительных результатов при постановке Premier Platinum HpSA теста на 4-6 неделе после успешно проведенной противохеликобактерной терапии. Полученные ложноположи-тельные результаты они объяснили возможностью персистенции в организме пролеченных пациентов кокковых форм H.pylori, количество которых, скорее всего, начинает со временем снижаться и полностью отсутствует на 8-12 неделе.

G. Masoero и соавт. показали, что подобные проблемы могут встречаться и при использовании для контроля лечения ¹³С УДТ.

Тем не менее, следует отметить, что потеря специфичности при использовании неинвазивных методов для контроля лечения не сопровождается потерей их чувствительности.

К преимуществам созданного нами ПЦР-теста можно, прежде всего, отнести его неинвазивность, простоту и быстроту выполнения (на постановку 30 исследований необходимо 4,5 - 5 часов) и относительно низкую себестоимость по сравнению с ИФА, дыхательным тестом, бактериологическим и гистологическим методами исследования. Ввиду невысокой стоимости данного теста он может быть использован не только для первичной диагностики H.pylori-инфекции, но и для эпидемиологических исследований.