Диагностика Chlamydia trachomatis методом Полимеразной Цепной Реакции

В мире накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) для выявления РНК/ДНК Chlamydia trachomatis в биологическом материале. Высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают этот метод во многом революционным в лабораторной диагностике.

Основными мишенями при выявлении Chlamydia trachomatis являются нуклеотидная последовательность видоспецифической криптической плазмиды, последовательность главного белка внутренней мембраны, рибосомальные гены.

ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотид-трифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при +94⁰С происходит разделение цепей ДНК, затем при +56⁰С - +60⁰C - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре +720C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5“ -3“. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.

Для выявления РНК хламидия trachomatis предварительно проводят стадию получения кДНК при реакции обратной транскрипции.

В клинической практике чаще всего определяют ДНК Chlamydia trachomatis.

По сравнению с широко используемыми в клинической практике иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:

• высокой специфичностью, которая обусловлена подбором праймеров комплементарных уникальной нуклеотидной последовательности тестируемых микроорганизмов, вирусов и т.д.;
• адекватной чувствительностью, позволяющей диагностировать не только острые, но и латентные инфекции в клинически значимом титре (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);
• сходный химический состав нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов;
• возможностью идентификации возбудителя в течение 4,5-5 часов.

Важной отличительной особенностью использования ПЦР является относительно низкая стоимость оборудования и тест-систем для проведения анализа, которые сочетаются с универсальностью метода.

Требования, предъявляемые к устойству ПЦР-лаборатрии

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты), которых должно быть не менее двух. В пре-ПЦР-помещении проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этом помещении (помещениях) запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории. В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены ультрафиолетовые лампы.

В пост-ПЦР-помещении проводится детекция продуктов амплификации. Это пмещение должно быть расположено как можно дальше от пре-ПЦР-помещений. В пост-ПЦР-помещении важно также исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.

Рабочие поверхности в ПЦР-лаборатории должны обрабатываться дезинфицирующими растворами.

Показания для диагностики Chlamydia trachomatis ПЦР-методом

В случае выявления фрагмента ДНК Chlamydia trachomatis после курса химиотерапии следует провести микробиологическую диагностику для исключения ложноположительного результата. Если проведение микробиологической диагностики невозможно, то необходимо через 5-6 недель (за это время происходит полное обновление эпителиального покрова мочеполовых путей) провести повторное исследование методом ПЦР.

• Острая фаза заболевания;
• Хроническая фаза заболевания;
• Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта;
• Беременность с отягощенным акушерским анамнезом;
• Бесплодие неясного генеза;
• Контроль эффективности проведенного антибактериального лечения.
• Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных лиц, больных туберкулезом, вирусным гепатитом и с вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические больные после курсов химио- и лучевой терапии, трансплантации костного мозга, получающие иммуносупрессивную терапию).

В 1991 году компания Хоффманла Рош ЛТД получила от компании Cetus права и патенты на использование ПЦР. В этом же году была создана компания Roche Molecular Systems, которая занимается исключительно вопросами развития и совершенствования ПЦР. В 1992 году этой компанией были внедрены первые стандартизованные тест-системы для проведения клинической ПЦР-диагностики - AMPLICOR Chlamydia trachomatis. В 1993 году начато производство этих тест-систем.

Многочисленные исследования показали высокую чувствительность и специфичность данного набора. Это позволило присвоить этой тест-системе сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для проведения одновременной их детекции в одной пробирке. В этом наборе были использованы биотинилированные праймеры (СР24/CР27) из криптической плазмиды Chlamydia trachomatis. Чувствительность теста составила 10 копий/мл, специфичность 99,6%.

Многочисленные исследования показали высокую чувствительность и специфичность данного набора. Это позволило присвоить этой тест-системе сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для проведения одновременной их детекции в одной пробирке. В этом наборе были использованы биотинилированные праймеры (СР24/CР27) из криптической плазмиды Chlamydia trachomatis. Чувствительность теста составила 10 копий/мл, специфичность 99,6%.

Научно-производственной фирмой “Литех” при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор отечественных реагентов “Полимик” в виде трех отдельных наборов для определения соответственно Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum. Каждый набор “Полимик” комплектуется отдельным набором для выделения ДНК из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от 18.03.96 г) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г (ТУ 9398-405-17253567-96).

Методика проведения анализа на Chlamydia trachomatis ПЦР-методом

При выполнении анализа методом ПЦР необходимо строго соблюдать протокол исследования, указанный в инструкции к конкретному ПЦР набору конкретного производителя. В общих чертах в постановке ПЦР можно выделить три основных этапа:

1. Выделение ДНК из клинического образца;
2. Амплификация специфических фрагментов ДНК;
3. Детекция продуктов амплификации;

Выделение ДНК из клинического образца.

На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации. Как правило, набор для выделения ДНК или РНК входит в комплект набора для проведения анализа методом ПЦР. В наборах для выделения ДНК у большинства фирм производителей, как правило, реализованы фенол-хлороформенный или сорбционный способы очистки ДНК. В 2001 г НПФ “Литех” был разработан и выпускается принципиально новый набор для выделения ДНК из биопроб “ДНК-Экспресс”, который также входит в комплект набора “Полимик” для определения ДНК Chlamydia trachomatis. В данном наборе используется метод термокоагуляционного кондиционирования ДНК. По сравнению с другими методиками выделения ДНК, которые основаны на использовании сорбентов, метод термокоагуляционного кондиционирования ДНК имеет следующие преимущества:

• процесс выделения ДНК из биопробы включает всего 3 стадии: перемешивание на вортексе, прогрев и центрифугирование. Это позволяет сократить время и трудозатраты на пробоподготовку. На обработку 24 проб требуется около 20 минут (для сорбентного метода пробоподготовки затрачивается около 1,5 часа).
• отпадает необходимость использования отдельного комплекса пипеток-дозаторов и вакуумного насоса с колбой-ловушкой на стадии пробоподготовки. Значительно сокращается расход одноразовых наконечников.
• поступившая в ПЦР-лабораторию пробирка с биопробой в процессе выделения ДНК ни разу не открывается вплоть до постановки амплификации. Это, в первую очередь, снимает проблему перекрестной контаминации.

Амплификация специфических фрагментов ДНК.

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для дальнейшей детекции. В большинстве методик определения специфических фрагментов генома Chlamydia trachomatis используется “классический” вариант ПЦР с использованием одной пары праймеров, которые ограничивают специфически синтезируемый фрагмент ДНК.

В комплект набора для амплификации входит пробирка с положительным контрольным образцом, который всегда анализируют параллельно с исследуемыми пробами для корректной оценки результатов амплификации на последнем этапе анализа. Кроме того, рекомендуется анализировать и отрицательный контрольный образец, которым может служить деионизованная вода, для оценки чистоты эксперимента (исключения возможности контаминации). Общей тенденцией для фирм-производителей ПЦР наборов в последнее время стало внедрение в тест-системы “внутреннего” контроля. Как правило, таковым контролем служит рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент неспецифичной для Chlamydia trachomatis ДНК, которая амплифицируется, но при этом синтезируется фрагмент ДНК отличный по своим размерам от синтезируемого фрагмента Chlamydia trachomatis. Наличие “внутреннего” контроля позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих ПЦР. Так, например, в состав реакционной смеси набора “Полимик” (НПФ “Литех”) входит внутренний контроль (рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент-вставку размером окло 500 н.п.), тогда как анализируемый фрагмент ДНК Chlamydia trachomatis имеет размер в 273 н.п.

Детекция продуктов амплификации

В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием ультрафиолетового облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

Набор “Полимик” Chlamydia trachomatis (НПФ “Литех”) (К-) - отрицательный контрольный образец, (К+) - положительный контрольный образец, (1-5) – клинические пробы.

Изображение с такого электро-форезного геля можно документировать фотографическим способом (с использованием оранжевого свето-фильтра) или при помощи специальных систем гель-доукументации на базе компьютера, переводящих изображение в цифровой формат.

Электрофоретический метод детекции продуктов амплификации самый простой в исполнении. Тем не менее, такой формат детекциии ПЦР-продуктов в настоящее время является устаревшим, в силу ряда существенных недостатков. Таковыми являются субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР реакции в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность представляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым. В этом случае при существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата.

Электрофоретический метод детекции продуктов амплификации самый простой в исполнении. Тем не менее, такой формат детекциии ПЦР-продуктов в настоящее время является устаревшим, в силу ряда существенных недостатков. Таковыми являются субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР реакции в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность представляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым. В этом случае при существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата.

Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы ДНК-гибридизации. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется с олигонуклеотидным зондом, специфичным к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Таким образом, при гибридизационном способе детекции ДНК специфичность реакции амплификации подтверждается несколько раз. Сначала в ходе самого этапа амплификации (отжига праймеров) и вторично при гибридизации получившегося продукта со специфичным зондом.

Гибридизационный способ детекции был предложен фирмой Хоффман-ла Рош и используется в наборе для ПЦР-диагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis. Из отечественных фирм-производите-лей гибридизационная схема детекции продуктов амплификации впервые была предложена НПФ “Литех” в технологической схеме “ПлаТАн” в 2000 году. В настоящее время для такого способа детекции адаптировано большинство ПЦР наборов производства НПФ “Литех”, в том числе и модифицированный набор для определения ДНК Chlamydia trachomatis – Полимик-“F”. При использовании данной технологии гибридизация осуществляется в специальных микропланшетах с применением флуоресцентных олигонуклеотидных зондов. Регистрация гибридизации осуществляется прибором – микропланшетным флуориметром Fluoroskan Ascent (Лабсистемс, Финляндия).

Калькуляция результата производится автоматически специально разработанной компьютерной программой и выводится на экран, как в символьном (“-”; “+”), так и в цифровом виде.

Основным преимуществом применения гибридизационных схем детекции амплифицированной ДНК является повышение точности анализа. Это достигается за счет исключения субъективности зрительной оценки врачом-лаборантом результатов электрофореза. Кроме того, такая схема более технологична, производительна и благодаря применению стандартизованного микропланшетного формата, поддается поэтапной или полной автоматизации.

Анализ результатов

В таблицах 6 и 7 приведены данные А.М. Савичевой и М.А. Башмаковой по выявлению Chlamydia trachomatis в клинических пробах различными методами исследования, в которых использованы выборки из исследований, когда Chlamydia trachomatis были обнаружены хотя бы одним из методов. Как видно из данных таблиц ПЦР-исследование наиболее информативно как при исследовании первичных материалов, так и при детекции ДНК хламидий в клеточной культуре, зараженной клиническим материалом.

Таблица 6
Сравнительная чувствительность прямых методов исследования (ПИФ, ПЦР, ИФА) при выявлении Chlamydia trachomatis в клинических образцах

Таблица 7
Сравнительная чувствительность прямых методов исследова-ния (ПИФ, ПЦР) при выявлении Chlamydia trachomatis в клеточной культуре, зараженной клиническим материалом