Лабораторная диагностика папиломмавирусной инфекции

В лабораторной диагностике применяют почти исключительно ДНК-методы. Существуют три основных категории лабораторных методов определения ДНК ВПЧ: неамплификационные, амплификационные и сигнальные амплификационные (табл. 3).

Таблица 3. Методы обнаружения ДНК вирусов папилломы человека

Неамплификационные методы определения ДНК ВПЧ в настоящее время с диагностической целью не используются. Они в ходу в научно-исследовательских лабораториях.

Среди амплификационных методов наибольшее распространение получила ПЦР, благодаря которой были получены ценные сведения о типах ДНК. Однако постановка ПЦР имеет большое количество ограничений, чтобы не получить ложноположительные результаты. Ограничения в первую очередь касаются строгого разграничения и разобщения по отдельным помещениям разных этапов работы, строгого соблюдения правил пользования перчатками, халатами, лабораторным оборудованием в пределах помещения, предназначенного для определенного этапа исследования, иначе может случиться перенос какого-либо количества ДНК с последующим его намножением в ПЦР. Кроме того, в мире еще нет стандартных реактивов для всех типов ВПЧ, практически используются праймеры и другие реактивы собственного лабораторного изготовления.

Не останавливаясь подробно на мишень-амшшфикационных методах, обратимся к сигнальным амплификационным методам, которые не требуют тех ограничений в деятельности, которые характерны для ПЦР-лабораторий. Среди них привлекает внимание система двойной генной ловушки Digene Hybrid Capture System II фирмы АЬЬоtt, которая обеспечивает:

• количественный анализ;
• компьютерную интерпретацию результатов, что исключает субъективизм в оценке;
• воспроизводимость и достоверность результатов;
• полный цикл исследования в течение одного рабочего дня;
• абсолютную специфичность.

Система двойной генной ловушки — Digene Hybrid Capture System II использует РНК-ДНК гибридизацию в растворе с последующей “хвостовой” иммунологической реакцией между гибридом РНК пробы — ДНК мишени и специфическими антителами к этому гибриду. Тест обязан своей высокой специфичностью нескольким независимым источникам. Во-первых, весь геном вируса является мишенью. Длинная одноцепочечная РНК эффективно гибридизуется со всеми 8000 нуклеотидов ДНК ВПЧ. Гибрид ДНК-РНК более стабилен, что позволяет избежать нежелательных побочных реакций.

Во-вторых, источником дополнительной чувствительности в реакции является использование антител к гибриду РНК-ДНК, конъюгированных с множеством молекул щелочной фосфатазы. Эти меченные антитела распознают короткие цепочки РНК-ДНК гибрида способом, который не имеет отношения к последовательностям нуклеотидов ДНК и РНК. Тысячи молекул антител могут покрыть единичный геномный гибрид ДНК ВПЧ.

В-третьих, каждый иммобилизированный энзим щелочной фосфатазы реагирует с множеством молекул хемилюминесцента диоксетана за 1 минуту и вызывает постоянный поток фотонов, которые прочитываются фотомультиплейерной трубкой люминометра.

В-четвертых, система генной ловушки имеет преимущества перед естественной амплификацией, т.к. вовлекает большой объем (10-20%) клинического материала в реакцию. Интенсивность испускаемого света пропорциональна количеству ДНК мишени и выражается как отношение сигнала к положительному контролю.

В “гибридной системе ловушки” — HCS II используются РНК-пробы, комплементарные к полной геномной последовательности 13 канцерогенных типов ВПЧ и 5 типов ВПЧ низкого риска. Составляются смеси — “коктейли” высокого и низкого риска соответственно. Каждый “коктейль” раздельно инкубируется с денатурированной (одноцепочечной) ДНК из клинического образца. Образующийся РНК-ДНК гибрид переносится в лунки микропанели, на которых иммобилизованы моноклональные антитела к РНК-ДНК гибриду. Антитела специфически распознают гибрид, который прикрепляется к лунке панели. Уловленные таким образом РНК-ДНК гибриды затем вступают в реакцию с моноклональными антителами к гибриду, меченными щелочной фосфатазой. Избыток антител и негибридизированных молекул удаляют промыванием. В лунки добавляют люминесцирующий субстрат диоксетан. Если субстрат присоединился к меченному щелочной фосфатазой конъюгату, то происходит испускание света. Эмиссию света можно измерить с помощью люминометра. Количество света генерируется в пропорции к числу мишеней ДНК в образце. НСS II может определить и различить канцерогенные типы ВПЧ (16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 68) и типы низкого риска (6, 11, 42, 43 и 44). Аналитическая чувствительность системы — 0,2 пикаграмма/мл (1000 копий генома ВПЧ). Учитывая клиническую необходимость обследования женщин с низкой степенью клеточной атипии, прибор установлен на определение 5000 копий ДНК/мл, т.е. на определение 1,0 пикаграмма/мл.

В комплексе с цитологическим исследованием, определение ВПЧ с использованием НСS II достигает 95% обнаружения ЦИН-1 и ЦИН-2, т.е. может служить эффективным дополнением к цервикальной цитологии и может помочь снизить заболеваемость и смертность от цервикального рака.

Использование гибридной ловушки для определения ДНК ВПЧ называют также методом улавливания гибридов.

Рекомендуется также использовать определение активности теломеразы как показатель возможной онкогенной тарнсформации.