Инвазивные методы диагностики Н.pylori -инфекции

Бактериологический метод

Наибольшую информацию о Н.pylori возможно получить только при выделении его из прижизненных биопсийных образцов. Это единственный метод исследования, обладающий 100% специфичностью. При этом виде исследования возможно не только выделение чистой культуры Н.pylori и ее идентификация, но и изучение морфологических, биохимических и биологических свойств возбудителя. Бактериологический анализ дает возможность определять антибиотикорезистентность у Н.pylori и проводить за ней динамические наблюдения.

В эпидемиологической практике выделение чистой культуры Н.pylori необходимо для внутривидового типирования штаммов, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, которое может быть обусловлено тем же штаммом.

В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности Н.pylori и изготовлять препараты для серологической диагностики.

Как и любой метод диагностики, бактериологический метод исследования обладает не только достоинствами, но и недостатками, которые зачастую ограничивают широкое использование этого метода в клинической практике. К недостаткам этого метода относятся, прежде всего, необходимость специального оборудования лаборатории и реактивов, специальных питательных сред, а также обученных кадров специалистов. Все это сопряжено с большими материальными затратами.

Результаты бактериологического исследования отсрочены от момента взятия биопсийного материала минимум на 3-5 дней, а при необходимости получения данных о чувствительности Н.pylori к антибактериальным препаратам длительность исследования увеличивается и составляет в среднем 6-7 дней. Выделение Н.pylori чаще всего происходит при обострении инфекции и наличии выраженных визуальных признаков воспаления. Еще одним из недостатков бактериологического метода является его инвазивность. Для его выполнения необходимо проведение эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) с взятием биопсийного материала.

Эндоскопия верхних отделов пищеварительного тракта является одним из ведущих методов диагностики при различных воспалительных заболеваниях органов пищеварения. Наиболее полно ее роль проявляется при заболеваниях, ассоциированных с Н.pylori, которые не имеют собственных выраженных клинических проявлений и зачастую скрываются под маской гастритов и язвенной болезни. При выполнении диагностической ЭГДС оценивается состояние стенок полых органов, перистальтика, количество и характер содержимого, вид слизистой оболочки, ее цвет, чистота, поверхность, сосудистый рисунок.

Эндоскопическая картина зависит от степени инвазии Н.pylori и активности процесса. К специфическим признакам Н.pylori-инфекции можно отнести, наличие язв в двенадцатиперстной кишке, множественных разнокалиберных выбуханий на стенках слизистой оболочки антрального отдела желудка, гиперемию слизистой оболочки, наличие мутной слизи в просвете желудка, отек и утолщение складок антрального отдела желудка. Чувствительность и специфичность отдельных признаков может быть различной. Наиболее достоверными являются язвы луковицы двенадцатиперстной кишки (чувствительность и специфичность 100%) и наличие разнокалиберных выбуханий на стенках антрального отдела желудка (чувствительность 93%, специфичность 96%) (П.Л. Щербаков, 2002). Эти выбухания в антральном отделе бывают столь выраженными, что получили название «нодулярного гастрита». При высокой степени обсемененности слизистой оболочки Н.pylori и значительной активности процесса эндоскопически будут определяться несколько признаков: гиперемия слизистой оболочки, мутная слизь в желудке и выраженные выбухания на стенках слизистой оболочки. По мере стихания активности процесса и уменьшении степени инвазии выраженность эндоскопических признаков Н.pylori-инфекции будет уменьшаться. При этом, в первую очередь, содержимое желудка становится прозрачным и гиперемия слизистой оболочки значительно уменьшается. Медленнее других исчезают выбухания слизистой оболочки.

Правила взятия и доставки биопсийного материала

Для бактериологического исследования необходимо взятие не менее двух биопсийных образцов из тела и антрального отдела желудка. В целях максимального исключения ошибки проводимого исследования (гипо- или гипердиагностика инфекции) оптимальным считается взятие 3-х биопсийных образцов. Обычно фрагменты слизистой оболочки желудка берутся из антрального отдела желудка по вершинам воображаемого равностороннего треугольника с привратником в центре, на расстоянии 2-4 см от него; из тела желудка по большой и малой кривизне и из свода желудка.

Обязательные условия при эндоскопии:

во время эндоскопии необходимо уделить особое внимание малой кривизне желудка и луковице двенадцатиперстной кишки, так как при язве в луковице может быть выраженный отек, а также возможен спазм мускулатуры желудка и двенадцатиперстной кишки, при котором достаточно сложно увидеть язву;
взятие биопсии требует особого внимания. Некоторые язвы иногда кровоточат и при неосторожном взятии биопсии это может привести к кровотечению. Изъязвления после биопсии успешно и достаточно быстро заживают. При биопсии, взятой из здоровой слизистой, риск кровотечения невелик. Если после биопсии начинается кровотечение, пациенту необходимо промыть место кровотечения холодной водой. В случае, если это не помогло, необходимо тампонировать место кровотечения биопсийными щипцами на 2-3 мин. Также для остановки кровотечения можно сделать инъекцию 1 мл 0,01% адреналина в ближайший к кровотечению участок.

Количество биопсийных образцов для бактериологического исследования

Вид исследования	Количество биоптатов
Первичное исследование	антральный отдел, вдоль большой кривизны – 2 средняя часть желудка – 1
Контроль лечения	антральный отдел, вдоль большой кривизны –1 средняя часть желудка – 2

Поскольку Н.pylori – микроаэрофил и очень чувствителен к условиям внешней среды (при избытке кислорода быстро погибает), необходимо строго соблюдать правила транспортировки биопсийного материала на бактериологическое исследование для того, чтобы сохранить этот микроорганизм в жизнеспособном состоянии. Лучшей, в настоящее время, для транспортировки биопсийных образцов признана Pylori-среда (BioMerioux, Фрынция), которая способна стабильно поддерживать жизнеспособность Н.pylori в биопсийном материале до 2-х суток. Чистая культура Н.pylori в этой среде может сохранять свою жизнеспособность в течение 4-5 дней. Если биопсийные образцы замораживаются при –700С, то посев биопсийного материала можно провести в течение месяца. Однако, глубокое замораживание необходимо проводить только в том случае, когда проведение бактериологического исследования по каким-то веским причинам невозможно провести в течение 24-48 часов.

Первичный посев биопсийного материала проводят на 2 питательные среды – селективную и неселективную. Для культивирования и выделения Н.pylori разработано большое количество неселективных питательных сред с 5-10% содержанием крови лошади, барана или кролика на основе агара: Muller-Hinton, Brucella, Columbia или Wilkins-Chalgren. Поскольку природная экологическая ниша Н.pylori не является стерильной, а иногда бывает нельзя исключить возможность контаминации биопсийного образца во время его взятия и транспортировки, то для выделения Н.pylori из биоптатов было предложено использовать специальные селективные питательные среды, содержащие антибактериальные и противогрибковые препараты, способные подавлять рост сопутствующей или контаминационной микрофлоры.

Выбор сред всегда зависит от возможностей микробиологической лаборатории. Среды должны быть свежеприготовленными. Готовые среды хранят при температуре +4⁰С-+6⁰С не более 2-х недель.

Время транспортировки (часы)	Среды
4-6	Физиологический раствор
6-24	Тиогликолевая среда Cary-Blaer Semi-solid Stuart’s (STM)
До 48	Pylori

Питательные среды для выделения Нelicobacter pylori

Вид среды	Состав среды
Неселективная среда	колумбийский агар – 37 г дистиллированная вода – 1000мл стерильная цельная баранья, лошадиная, или кроличья кровь – 100 мл
Селективная среда	полимиксин В – 2500 МЕ/л ванкомицин – 10 мг/л триметоприм – 5 мг/л амфотеррицин В – 10 мг/л трифенилтетразолий хлорид – 40 мг/л

Перед посевом биопсийного материала на питательные среды его помещают в 0,5 мл свежеприготовленного физиологического раствора и гомогенизируют при помощи механического гомогенизатора в течение 1 мин (электрическим гомогенизатором при 10 000 об/мин в течение 10-20 с). Затем по две капли гомогенизированного раствора помещают на поверхность чашек с селективной и неселективной питательной средой. Посев производят сплошным газоном с помощью стеклянного шпателя или бактериологической петли.

Дезинфекция гомогенизатора проводится в 2% глутаральдегиде или 96% спирте.

Если лаборатория не имеет оборудования для гомогенизации биопсийного материала, то его непосредственно помещают на чашку Петри с селективной питательной средой и растирают по ее поверхности с помощью петли или стеклянного шпателя. В этом случае выделение чистой культуры Н.pylori менее успешно, так как бактерии бывает сложно отделить от слизистой и сама по себе селективная среда может опосредованно, за счет антибиотиков входящих в ее состав, препятствовать росту Н.pylori.

При культивировании Н.pylori могут возникнуть определенные трудности, которые связаны с созданием микроаэрофильных условий. Необходимую для культивирования атмосферу создают заполнением анаэростатов газовой смесью с помощью коммерческих газогенерирующих пакетов, например производства BioMerioux, Фрынция. Газогенерирующие пакеты удобны, прежде всего, тем, что используемая в них вода создает в микроанаэростате необходимую для роста Н.pylori влажность. В том случае, если микроанаэростат заполняется газовой смесью извне, внутрь анаэростата необходимо положить фильтровальную бумагу, смоченную водой.

Условия инкубации Нelicobacter pylori

Температура +37⁰C
О₂ – 5-6%
СО₂ – 8-10%
N₃ –до 80-85%
Влажность – 95%

Время инкубации: - первичное исследование – 7 дней - контроль лечения - 14 дней

Оптимальный рост кологий наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Многие штаммы Н.pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +32⁰С - +39⁰С, но не растут при +27⁰С - +42⁰С.

Чашки просматривают ежедневно в течение 7 дней. Если исследование проводится после лечения, чашки инкубируют 14 дней.

На неселективной питательной среде Н.pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Н.pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида.

При получении колоний по морфологии сходных с Н.pylori, проводится их идентификация, которая включает в себя окраску мазка по Граму и три биохимические теста – уреазный, каталазный и оксидазный.

При окраске мазка по Граму Н.pylori выглядят в виде грамотрицательных изогнутых S-образных или V-образных палочек.

Уреазный тест с чистой культурой Н.pylori можно ставить в пробирках типа эппендорф. В побирки вносится 2% раствор мочевины по Кристенсену с индикаторои– феноловым-красным, а затем в него добавляется исследуемая культура. Результаты реакции наблюдаются уже в первую секунду – раствор мочевины резко изменяет свою окраску с ярко желтой на темно малиновую. Более медленно, как правило, в этом тесте реагируют кокки, протеи и др. В качестве отрицательного контроля используют культуру E.coli.

Идентификация Helicobacter pylori

1. Мазок, окрашенный по Граму

2. Биохимические тесты:-уреазный -оксидазный - каталазный

Тест на способность продукции цитохромоксидазы (оксидазный тест) выполняют следующим образом: каплю 1% водного раствора тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида наносят на исследуемые колонии непосредственно на поверхности чашки. Через 20-30 с оксидазопозитивные колонии Н.pylori окрашиваются в темный цвет. Этот же тест можно выполнить на фильтровальной бумаге, на которую петлей наносят агаровую культуру и сверху – каплю реактива. Через 5-10 с позитивная культура Н.pylori приобретает пурпурную окраску. Контролем служат суточные агаровые культуры E.coli (негативный контроль) и P.aerugenosa (позитивный контроль).

Тест на каталазную активность проводят в капле Н2О2 на стекле: через 3-5 с в взвеси каталазопозитивной культуры Н.pylori происходит образование пузырьков газа. Позитивным контролем служит суточная агаровая культура E.coli, негативным – любой стрептококк.

Фазово-контрастная микроскопия

Н.pylori может быть обнаружен до микробиологического исследования при помощи фазово-контрастной микроскопии. Этот метод весьма удобен для обнаружения Н.pylori, при условии достаточно высокой степени обсеменения.

Преимущества фазово-контрастной микроскопии:

нет необходимости проводить фиксацию материала и дополнительных окрасок ткани;
исследование можно проводить в обычных лабораторных условиях;
результат может быть получен через 1-2 мин.

Процедура выполнения исследования:

Поместить биоптат на предметное стекло.
Измельчить биоптат на стекле и добавить каплю физиологического расвора.
Поместить на измельченный биоптат покровное стекло.
Поместить приготовленный препарат в фазово-контрастный микроскоп.

Микроскопия проводится с увеличением в 100 раз с использованием иммерсионного масла.

В препарате – типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.

Гистологический метод

Этот наиболее объективнй метод диагностики Н.pylori инфекции, так как позволяет обнаружить возбудитель этой инфекции, определить положение бактериальных тел в слизи, покрывающей СОЖ, наблюдать взаимоотношение Н.pylori с апикальной мембраной эпителиоцитов, а также определить пути взаимодействия микроба с тканями макроорганизма.

Взятие биопсийного материала производится из мест с максимально выраженной гиперемией и отeком. Взятие материала из дна язв и эрозий, а также из их краев, является ошибкой, поскольку в них нет эпителиальных клеток, обладающих свойствами, необходимыми для адгезии и колонизации Н.pylori. Поскольку бактерии Н.pylori могут быть разбросаны по СОЖ в виде очагов, то для повышения чувствительности метода биоптаты целесообразно брать из разных частей желудка. Гистологический метод позволяет также и оценить состояние СОЖ.

При гистологическом исследовании проводится микроскопия парафиновых срезов, окрашенных различными методами - гемотоксилином-эозином, Романовского-Гимза, Вартина-Старри, генциан-виолетом, Гомери, Гента.

Оценка биопсийных образцов проводится в соответствии с Сиднейской классификацией (1990 г.). Н.pylori определяются в виде мелких слегка извитых палочек, находящихся в просвете желудка в непосредственной близости от собственной пластинки СОЖ и на поверхности эпителиальных клеток.

Выделяют 3 степени обсемененности Н.pylori:

слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зрения;
средняя (+) - до 50 микробных тел в поле зрения;
высокая (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения.

Гистологическое исследование имеет ряд преимуществ: широкая доступность, удобство хранения и транспортировки препаратов и возможность оценки в любое время любым специалистом, который легко может проводить ретроспективный анализ. Гистологический метод позволяет оценить любую из форм повреждения СОЖ.

Иммуногистохимический метод

Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антителами против Н.pylori. Готовые к применению коммерческие наборы с моноклональными антителами работают при разведении 1:200000 и избирательно окрашивают только Н.pylori. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при исключительно низкой степени обсемененности СОЖ Н.pylori, когда морфологический метод и уреазный тест дают ложноотрицательные или сомнительные результаты. Он также используется для выявления мофологически измененных (кокковых форм) Н.pylori.

Быстрый уреазный тест (оценка местной уреазной активности)

В основу определения уровня желудочной уреазной активности положен следующий принцип: уреаза катализирует быстрый гидролиз мочевины, находящейся в содержимом желудка. В результате реакции образуется аммиак и углекислый газ. рН среды сдвигается в щелочную сторону и это изменение можно зафиксировать с помощью индикатора. Быстрота изменения окраски индикатора зависит от уреазной активности, которая, в свою очередь, зависит от количества бактерий. В некоторых случаях уреазный тест становится положительным через несколько минут. При малом количестве бактерий изменение окраски в уреазном тесте может произойти через несколько часов, а иногда возможен и ложноотрицательный результат.

малом количестве бактерий изменение окраски в уреазном тесте может произойти через несколько часов, а иногда возможен и ложноотрицательный результат.

При проведении уреазного теста нужно учитывать и тот факт, что он может быть положительным у лиц, желудок которых колонизирован H.heilmanii, имеющим близкое сродство с Н.pylori.

Время появления малинового тона косвенно указывает на количество микроорганизмов:

(+) - незначительная инфицированность (малиновое окрашивание к концу суток);
(++) - умеренная инфицированность (малиновое окрашивание в течение 2 часов);
(+++) - значительная инфицированность (малиновое окрашивание появляется в течение первого часа)
(-) - отрицательный результат (малиновое окрашивание не наступает).

В России чаще всего используется уреазный тест, приготовленный, непосредственно в лаборатории. Этот тест экономичен, надежен, прост в использовании.

Применяемые реагенты:

Мочевина - 2 г
Феноловый красный 0,5% - 10 г
Азид натрия - 20 мг
0,01М фосфатный буфер рН 6,5 - 100 мл

Метод приготовления:

Готовят по обычной рецептуре: 0,01М фосфатный буфер рН 6,5 разливают по флаконам, стерилизуют при +121⁰С 15 мин. К охлажденному буферу добавляют мочевину – 2 г, раствор фенолового красного и азид натрия (обладающий свойствами консерванта). Цвет реактива должен быть желто-розовым. При подкислении реактива его цвет меняется на соломенно-желтый, при подщелачивании – на малиновый. Приготовленный реактив должен быть соломенно-желтого цвета и может длительно храниться в темной упаковке при температуре +2⁰С - +6⁰С.

Процедура выполнения теста (с 2% мочевиной):

Поместить 2 капли реагента в пробирки типа эппендорф.
Поместить биопсийный материал в первую пробирку, вторая пробирка используется в качестве контрольной.
Плотно закрыть пробирки.
Записать время начала выполнения теста.
Микропробирки инкубируют при температуре +37⁰С.
Учитывать результат через 20 мин, 1 ч, 3 ч, 24ч.

При проведении контроля лечения возможно увеличение интервалов времени изменения цвета реактива или получение ложноотрицательных результатов, поэтому тест в данном случае считается неспецифичным.

Учет результатов и показатели изменения времени окраски реагента через определенные промежутки времени

	Время учета
	20 мин	1ч	3 ч	24 ч
% положительных результатов	75	85	90	95

Последующие модификации БУТ дали возможность получения более быстрого результата. При использовании незабуферного раствора мочевины положительный результат регистрируют в течение 1 мин у 90% больных хеликобактериозом, подтвержденным бактериологически. Однако этот метод может давать положительные результаты, если результат оцениваерся позже 1 минуты.

В связи с этим, было предложено использовать 6% раствор мочевины. В этом случае результаты теста учитываются в течение 15 мин.

К недостаткам теста относится его инвазивность, получение ложноотрицательных (при малом количестве микробных тел) или ложноположительных (контаминирование материала другими уреазопродуцентами) результатов, а также невозможность оценить состояние СОЖ.

Этот тест неприемлем для выявления других возможных очагов локализации Н.pylori в желудочно-кишечном тракте - в ротовой полости и толстой кишке из-за нейтральной среды и из-за присутствия там большого количества других уреазопродуцентов. Невозможность использования уреазного теста для обнаружения во внешней среде очевидна не только из-за его недостаточной чувствительности, но и потому, что Н.pylori во внешней среде могут принимать кокковую форму, которая не проявляет ферментативной активности.

Молекулярно-биологический метод (ПЦР-исследование)

В мире накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР (полимеразная цепная реакция) для выявления ДНК Н.pylori в биопсийном материале. Высокие показатели чувствительности и специфичности ПЦР делают этот метод во многом революционным в лабораторной диагностике.

ПЦР представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров, которые определяют границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при +940С происходит разделение цепей ДНК, затем при +560С - +600C - присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре +720C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5‘ -3‘. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.

ПЦР-диагностика обладает рядом преимуществ:

высокой специфичностью, которая обусловлена подбором праймеров комплементарных уникальной нуклеотидной последовательности тестируемых микроорганизмов, вирусов и т.д.;
адекватной чувствительностью, позволяющей диагностировать не только острые, но и латентные инфекции в клинически значимом титре (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);
сходный химический состав нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов;
возможностью идентификации возбудителя в течение 4,5-5 часов.

Важной отличительной особенностью ПЦР-диагностики является относительно низкая стоимость оборудования и тест-систем для проведения анализа, которые сочетаются с универсальностью метода.

Требования, предъявляемые к устойству ПЦР-лаборатрии

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты), которых должно быть не менее двух. В пре-ПЦР-помещении проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этом помещении (помещениях) запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории. В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены ультрафиолетовые лампы.

В пост-ПЦР-помещении проводится детекция продуктов амплификации. Это пмещение должно быть расположено как можно дальше от пре-ПЦР-помещений. В пост-ПЦР-помещении важно также исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.

Рабочие поверхности в ПЦР-лаборатории должны обрабатываться дезинфицирующими растворами.

Показания для диагностики Н.pylori-инфекции методом ПЦР

Острая фаза заболевания;
Хроническая фаза заболевания;
Установление этиологии хронического инфекционного процесса при гастрите и язвенной болезни;
Контроль эффективности проведенного антибактериального лечения.

В случае выявления фрагмента ДНК Н.pylori через 4 недели после курса противохеликобактерной терапии следует провести микробиологическую диагностику хеликобактериоза для исключения ложноположительного результата. При выделении из биопсийного материала Н.pylori необходимо определение его чувствительности к антибактериальным препаратам, которые входили в состав противохеликобактерной терапии. Если проведение микробиологической диагностики невозможно, то необходимо через 5-6 недель провести повторное исследование на хеликобактериоз методом ПЦР.

Научно-производственной фирмой “Литех” при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускается набор отечественных реагентов “Хеликопол” для определения ДНК Н.pylori в биопсийном материале. Набор «Хеликопол» комплектуется отдельным набором для выделения ДНК из биопсийного материала. Инструкция по применению набора реагентов рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от 18.03.96 г) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г (ТУ 9398-405-17253567-96).

Методика проведения анализа методом ПЦР

При выполнении анализа методом ПЦР необходимо строго соблюдать протокол исследования, указанный в инструкции к конкретному ПЦР набору конкретного производителя. В общих чертах в постановке ПЦР можно выделить три основных этапа:

Выделение ДНК из клинического образца;
Амплификация специфических фрагментов ДНК;
Детекция продуктов амплификации.

Выделение ДНК из биопсийного материала

На данной стадии проведения анализа биопсийный материал подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК,свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплифи-кации. В наборе для выделения ДНК НПФ «ЛИТЕХ» реализован сорбционный способ очистки ДНК.

Методика экстракции и очистки ДНК Н.pylori:

биопсийный материал из желудка и/или двенадцатиперстной кишки помещается в 100 мкл лизирующего раствора, содержащего 10 мМ Трис HCl рН 8,8, 25 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл протеиназы К и инкубируется при температуре +65⁰С в течении 4-х часов (до полного растворения биопсийного материала);
к полученному раствору добавляется 10 мкл водной суспензии сорбента и 300 мкл буфера (раствор I), состоящего из 10 мМ Трис HCl рН 8,0, 5,5 М гуанидин тиоцианата и 10 мМ ЭДТА;
к полученному раствору добавляется 10 мкл водной суспензии сорбента и 300 мкл буфера (раствор I), состоящего из 10 мМ Трис HCl рН 8,0, 5,5 М гуанидин тиоцианата и 10 мМ ЭДТА;
суспензия инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин с периодическим вортексированием;
супернатант удаляется с помощью вакуумного насоса;
сорбент однократно промывается в 150 мкл промывочного раствора (р-р II);
сорбент двукратно промывается в 1000 мкл промывочного раствора (р-р III);

Амплификация специфических фрагментов ДНК

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для дальнейшей детекции. В методике, предложенной НПФ «ЛИТЕХ» для определения специфических фрагментов генома Н.pylori используется «классический» вариант ПЦР с использованием одной пары праймеров, которые ограничивают специфически синтезируемый фрагмент ДНК.

В комплект набора «Хеликопол» для амплификации входит пробирка с положительным контрольным образцом, который всегда анализируют параллельно с исследуемыми пробами для корректной оценки результатов амплификации на последнем этапе анализа. Кроме того, рекомендуется анализировать и отрицательный контролтный образец, которым может служить деионизованная вода, для оценки чистоты эксперимента (исключения возможности контаминации).

Детекция продуктов амплификации

В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образущий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием ультрафиолетового облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

Изображение с такого электрофорезного геля можно документировать фотографическим способом (с использованием оранжевого светофильтра) или при помощи специальных систем гель-документации на базе компьютера, переводящих изображение в цифровой формат.

Электрофоретический метод детекции продуктов амплификации самый простой в исполнении. Тем не менее, такой формат детекциии ПЦР-продуктов в настоящее время является устаревшим, в силу ряда существенных недостатков. Таковыми являются субъективность оценки результатов электрофореза оператором, низкая производительность, невозможность автоматизации процесса, трудность количественной оценки продуктов ПЦР реакции в каждом конкретном образце. Наибольшую опасность представляет возможность наработки в ходе ПЦР неспецифического продукта, сходного по размерам с детектируемым. В этом случае при существующей системе детекции возможна выдача оператором ложноположительного результата.

Набор «Хеликопол» НПФ «Литех» (К-) - отрицательный котрольный образец, (К+) - положительный контрольный образец, (1-5) – клинические пробы.

Альтернативой электрофоретическим методам детекции ПЦР-амплифицированной ДНК являются методы ДНК-гибридизации. В ходе такого способа детекции амплифицированная ДНК гибридизуется с олигонуклеотидным зондом, специфичным к внутренней последовательности анализируемого фрагмента. Образовавшийся гибрид автоматически регистрируется флуоресцентным или фотометрическим ридером. Та