ПЦР-диагностика анаэробных инфекций, вызываемых бактериями рода Bacteroides

Струкова Л.А. (специалист по продукции), Атрошкина М. Е. (научный сотрудник) OOO НПФ "Литех"

В настоящее время отмечается значительное увеличение доли инфекционных заболеваний, в патогенезе которых ведущую роль играют анаэробные бактерии. Подобные инфекции, как правило, полимикробные, при этом анаэробные возбудители встречаются в ассоциации с другими анаэробными или аэробными микроорганизмами.

Выявление анаэробных микроорганизмов традиционно является серьезной проблемой для клинической бактериологической лаборатории. Большинство видов плохо культивируются или не культивируются вообще, кроме того стандартные микробиологические методы длительны по времени и их результаты становятся известны лишь на 3 – 4 день от момента взятия материала. Однако, во многих случаях, в частности при развитии анаэробной инфекции в ранах у хирургических больных, времени на длительные исследования просто нет, поскольку необходим срочный выбор адекватной антибактериальной терапии.

Ускорить диагностику и облегчить понимание генетических основ патогенности и антибиотикорезистентности анаэробных бактерий, вызывающих тяжелые инфекции человека, возможно путем применения в практике бактериологических лабораторий новых методов на основе анализа генетического материала бактерий, в частности метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) (1).

Возбудителей анаэробных инфекций принято разделять на 2 группы. К первой группе относят спорообразующих анаэробов, или клостридий. Вторая группа представлена неспорообразующими, или неклостридиальными, анаэробами (бактероиды, фузобактерии, пептококки, пептострептококкиидр.).

Анализ видового состава бактерий, выделяемых из очагов воспаления с участием анаэробной микрофлоры, показал, что среди неспорообразующих анаэробов основную долю составляют Bacteroides fragilis (85,7 %), Peptococcus spp. (71,4 %), Peptostreptococcus spp. (69,8 %), Prevotella melaninogenica (68,7 %), Fusobacterium nucleatum (42,6 %) Частота выделения неспорообразующих анаэробов при тяжелых гнойных заболеваниях колеблется от 57,1 % до 98,8 % в зависимости от характера и локализации патологического процесса. (2).

Осознавая необходимость и востребованность надежных тест-систем для выявления анаэробной флоры, начиная с 2012 года в ООО НПФ «Литех» ведутся работы над созданием соответствующих диагностических панелей. Поскольку среди анаэробов, выделяемых из клинического материала человека, представители рода Bacteroides spp. занимают лидирующие позиции, а их рутинная фенотипическая идентификация представляет собой весьма трудоемкий процесс с частыми ошибками (1), первыми на рынок диагностических услуг выпущены ПЦР тест-системы «БАКТОПОЛ» для обнаружения различных видов бактероидов, а также штаммов B.fragilis, продуцирующих энтеротоксин:

1. Бактопол-1 (Bacteroides caccae);
2. Бактопол-2 (Bacteroides distasonis, merdae);
3. Бактопол-3 (Bacteroides eggerthii, stercoris, uniformis);
4. Бактопол-4 (Bacteroides fragilis ,vulgatus, thetaiotomicron, ovatus);
5. Бактопол-токсин (Bacteroides fragilis toxin, BFT).

Наборы серии «БАКТОПОЛ» реализуют принцип обнаружения специфичных участков геномной ДНК бактероидов в реакции амплификации с гибридизацией с флуоресцентными зондами. Детекция продуктов ПЦР происходит в ходе реакции (в режиме реального времени) или после окончания процесса. Возможна электрофоретическая детекция. Материалом исследования служит клинический материал, забираемый от пациентов - кал, урогенитальные соскобы, раневое отделяемое, мазки из зева и др. Применение наборов серии «БАКТОПОЛ» позволяет установить видовой состав бактерий рода Bacteroides в клинических образцах, а также дать оценку патогенного потенциала Bacteroides fragilis путем обнаружения генов продукции энтеротоксина.

На сегодняшний день к роду Bacteroides spp. относят 14 видов, 10 из которых принадлежат к группе B. fragilis: B. caccae, B. distasonis, B. eggerthii, B. fragilis, B. merdae, B. ovatus, B. stercoris, B. thetaiotaomicron, B. uniformisи B. vulgatus. Присутствуя в организме человека, бактероиды могут вызывать различные гнойно-воспалительные заболевания (перитонит, абсцессы, эндокардит, сепсис, тонзиллит, пародонтоз, поражения костей и суставов) после травм, оперативных вмешательств, инструментальных исследований, при онкопатологиях или иммунодефиците. Бактероиды являются причиной  заболеваний женских внутренних половых органов: цервицитов, эндометритов, инфекций малого таза. Обнаруживают бактероиды и у мужчин (примерно у 6 % пациентов с осложненным постгонорейным уретритом), у больных с хроническим течением заболевания и частыми рецидивами. У детей наличие бактероидов отмечено при перитонитах, остеомиелитах, целлюлитах, бактериемии. Бактероиды могут быть ассоциированы с болезнью Крона (B. vulgatus) и другими заболеваниями кишечника (B. fragilis , B. thetaiotaomicron и B. caccae) (3). Смертность при бактериемии, вызванной Bacteroides, может составлять до 50% в зависимости от выявленного вида ( В. thetaiotaomicron> B. distasonis> B. fragilis); и пока не ясно, связано ли это с различиями в факторах вирулентности или с антимикробной чувствительностью (4). Несомненно, уровень смертности может быть существенно снижен за счет своевременной диагностики инфицирования бактероидами и назначения этиотропной антимикробной терапии.

В патогенезе анаэробных инфекций важную роль играет воздействие бактериальных токсинов на ткани и органы человека (2). Изоляты B. fragilis, выделяемые, как правило, при сепсисе и желудочно кишечных заболеваниях, продуцируют токсин -Bacteroides fragilis toxin, BFT, который является цинковой металлопротеазой с молекулярным весом 20 kDa. Энтеротоксигенные штаммы могут продуцировать три варианта (изотипа) энтеротоксинов, кодируемых генами bft-1, bft-2 и bft-3 (5). Энтеротоксигенные штаммы с высокой частотой выделяют также у пациентов с инфекциями легких, крови и при абсцессах. Энтеротоксин разрушает клеточные контакты между эпителиальными клетками и является потенциальной причиной диареи (до 10% случаев) (6). Продуцирующие энтеротоксин изоляты B. fragilis обнаружены у детей младшего возраста, страдающих диареей (1-5 лет) (3). Тем не менее, некоторые клинические исследования свидетельствуют, что до 20 % человеческой популяции являются асимптоматическими носителями энтеротоксигенных штаммов (5).

Лабораторная диагностика анаэробной инфекции в среднем занимает от 7 до 10 суток, что не может удовлетворять клиницистов. Основными способами диагностики анаэробной инфекции являются биохимический, культуральный, микроскопический, газожидкостной хроматографии, люминесцентной микроскопии, способы определения токсинов анаэробов в отделяемом из ран и крови больных. Но всем этим способам присущи те или иные недостатки: длительность исследования, малая точность, громоздкость анализа, неотработанность методик и др.

В последнее время накапливается все больше информации об успешном применении метода ПЦР для быстрого и качественного обнаружения бактерий рода Bacteroides по сравнению с традиционными способами идентификации анаэробных микроорганизмов. ПЦР-диагностика занимает всего несколько часов и отличается высокой чувствительностью и специфичностью. При изучении 400 образцов хирургической раневой инфекции путем количественной ПЦР в режиме реального времени (кРВ-ПЦР) Tong J. с соавт. в 132 образцах (33%) идентифицировали виды Bacteroides spp (7). Методом культивирования бактероиды были обнаружены только в 31 образце (8%). B. uniformis был наиболее распространенным видом (44 положительных образца) по результатам кРВ-ПЦР, в то время как метод культивирования идентифицировал эту бактерию как B. fragilis (16 положительных образцов). Данное исследование подтвердило, что ПЦР является быстрым, специфичным и чувствительным методом, который имеет большой потенциал для выявления группы B. fragilis и родственных организмов в образцах ран.

Liu C. и соавт. представили новую схему для идентификации 10 видов бактероидов из группы Bacteroides fragilis с помощью мультиплексной ПЦР. В результате были идентифицированы 155 изолятов этой группы, ранее определенных с помощью стандартных фенотипических тестов (8). Эффективность стандартных способов идентификации составила всего 84.5%. Таким образом, мультиплексная ПЦР оказалась простым, быстрым и надежным методом для определения видов группы B.fragilis. Этот метод может позволить более точно определять роль представителей этой группы в развитии инфекций и их степень устойчивости к противомикробным препаратам.

Для обнаружения токсинов "золотым стандартом" в мире является исследование цитотоксического эффекта на различные клеточные линии, в случае B. fragilis – это линия HT-29. Наличие цитопатического эффекта (ЦПЭ) должно сравниваться с отрицательным контролем (фосфатно-солевой буфер или клеточная среда). Если ЦПЭ обнаружен, проводят нейтрализацию с антитоксином для подтверждения энтеротоксина, поскольку некоторые вирусы и бактерии также могут привести к возникновению ЦПЭ у клеточных линий. Недостатками этого метода являются его трудоемкость и большие временные затраты (1).

В течение последних 5 лет было разработано много способов на основе метода ПЦР для обнаружения токсина B. fragilis. Чувствительность и специфичность этих способов по сравнению с культивированием составляют около 91 % и 100 %, соответственно, но эти значения могут быть немного меньше при работе с образцами кала из-за присутствия ингибиторов ПЦР (1).

В последние годы было отмечено повышение устойчивости к противомикробным препаратам для некоторых анаэробных бактерий, особенно для видов группы B. fragilis (9). Связанная с продукцией пенициллаз устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам среди анаэробов приближается к 100%, быстро растет резистентность к тетрациклинам; резистентность к цефамицину (цефокситину), эритромицину и клиндамицину составляет около 12-30% во всем мире, что делает их непригодными для эмпирической терапии против Bacteroides (1). Интересно, что B. fragilis более восприимчив к антимикробным препаратам, чем другие виды Bacteroides. B. vulgatus наиболее устойчив к ампициллину-сульбактаму и пиперациллин-тазобактаму. Штаммы B. thetaiotaomicron/ovatus показывают самый высокий уровень устойчивости к карбапенемам с неизвестным механизмом резистентности. B. vulgatus резистентен к моксифлоксацину (10).

Учитывая устойчивость отдельных видов Bacteroides spp. к разным антибиотикам, при выборе адекватной антимикробной терапии желательно опираться на данные ПЦР-тестирования, охватывающего все разнообразие видов, ассоциированных с тяжелыми инфекциями человека.

Таким образом, метод ПЦР имеет решающее значение для диагностики инфекций, вызванных представителями рода Bacteroides. Несмотря на тот факт, что роль анаэробных бактерии в патогенезе различных заболеваний человека подтверждена, качество лабораторной диагностики анаэробных инфекций остается спорным. Тем не менее, выявление и изучение важных генов анаэробных бактерий с помощью молекулярно-генетических методов могут привести к получению более точных данных об их патогенности и позволят избежать проблем, связанных с особыми условиями культивирования и крайне медленным ростом (1). Применение наборов серии «БАКТОПОЛ» как дополнение к традиционному бактериологическому тестированию, позволяет существенно повысить результативность и информативность проводимых клинико-лабораторных исследований, что в свою очередь снизит риск возникновения осложнений и смерти при инфекциях, вызванных группой B. fragilis, а также будет способствовать назначению эффективной этиотропной терапии.

Наша клиника проводит все виды анализов (анализ на сахар, на аллергию, ПЦР, генетический анализ и др.) с применением современного оборудования и проверенных методов.

Литература:

1) Nagy E, et al. The place of molecular genetic methods in the diagnostics of human pathogenic anaerobic bacteria. A minireview. Acta Microbiol Immunol Hung. 2006 Jun; 53(2):183-94.
2) А. М. Светухин А. Б. Земляной В. Г. Истратов Л. А. Блатун Р. П. Терехова. Клиническое значение ранней диагностики анаэробной неклостридиальной инфекции.Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова № 8. 2005.
3) Hannah M. Wexler. Bacteroides: the Good, the Bad, and the Nitty-Gritty. Clin Microbiol Rev. 2007 October; 20(4): 593–621.
4) Brook, I. 2002. Clinical review: bacteremia caused by anaerobic bacteria in children. Crit. Care. 6:205-211.
5) Merino VR et al. Quantitative detection of enterotoxigenic Bacteroides fragilis subtypes isolated from children with and without diarrhea. J Clin Microbiol. 2011 Jan; 49(1):416-8.
6) Durmaz B, Dalgalar M, Durmaz R. Prevalence of enterotoxigenic Bacteroides fragilis in patients with diarrhea: a controlled study. Anaerobe. Dec 2005; 11(6):318-21.Anaerobe. 2005 Dec; 11(6):318-21.
7) Tong J, Liu C, Summanen P, Xu H, Finegold SM. Application of quantitative real-time PCR for rapid identification of Bacteroides fragilis group and related organisms in human wound samples. Anaerobe.2011 Apr;17(2):64-8.
8) Liu C. et al. Rapid identification of the species of the Bacteroides fragilis group by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers. FEMS Microbiol Lett. 2003 May 16; 222(1):9-16.
9) Simmon KE, Mirrett S, Reller LB, Petti CA. Genotypic diversity of anaerobic isolates from bloodstream infections. J Clin Microbiol. 2008 May; 46(5):1596-601.
10) Fernández-Canigia L. et al. First national survey of antibiotic susceptibility of the Bacteroides fragilis group: emerging resistance to carbapenems in Argentina. Antimicrob Agents Chemother. 2012 Mar;56(3):1309-14.