Генотипирование Helicobacter pylori

Распределение генотипов Helicobacter pylori в различных регионах РФ с учетом гастродуоденальной патологии

Несмотря на высокий процент инфицирования населения Helicobacter pylori подавляющее большинство инфицированных лиц не имеют клинических проявлений на момент диагностики, но они, тем не менее, представляют собой группу риска, в которой с течением времени развивается хронический гастрит, ЯБЖ, ЯБДК, экстранодальня В-клеточня MALT-лимфома или аденокарцинома желудка.

К настоящему времени у двух штаммов H.pylori (J99 и 26695) определены полные последовательности генома. Геном H.pylori содержит 1600 генов (J. Tomb, 1997; R. Alm, 1999). Ряд генов, продукты которых – белки CagA, VacA, IceA, BabA, считаются факторами патогенности.

Ген cagA (cytotoxin-associated – маркер gene) островка патогенности - cag (cag-PAI) кодирует белки IV секреторной системы Helicobacter pylori, функция которой состоит в доставке эффекторных молекул микроорганизма в клетки макроорганизма. Они позволяют H.pylori модулировать метаболизм эпителиоцитов слизистой оболочки желудка, включая и экспрессию протоонкогенов.

Продукты генов, входящих в состав островка патогенности, способны переносить cagA непосредственно в эпителиоциты слизистой оболочки желудка, где он подвергается фосфорилированию. Фосфорилирование cagA внутри эпителиоцитов приводит к изменению их цитоскелета, в результате чего происходят морфологические изменения эпителиоцитов. Гены островка патогенности также принимают участие в модуляции экспрессии генов эпителиальных клеток, кодирующих митоген-активируемые протеинкиназы, ядерный фактор kB (NF-kB) и активирующий белок-1 (АР-1). Транскрипция гена интерлейкина 8 (ИЛ-8) эпителиоцитами слизистой оболочки желудка также зависит от экспрессии ряда генов, входящих в состав островка патогенности H.pylori.

Другой фактор патогенности H.pylori - ген vacA (vacuоlating-associated cytotoxin) является цитотоксином, который экскретируется и повреждает эпителиальные клетки желудка. При низких значениях рН неактивные додекамеры токсина распадаются на мономеры, которые взаимодействуют с липидным бислоем и восстанавливаются как гексамерные, анион-селективные мембранные каналы. Увеличение проницаемости анионов через эти каналы является свойством всех vacA-продуцирующих штаммов H.pylori (T. Cover, 1992; 1996).

Вакуолизирующий цитотоксин кодируется геном vacA, который присутствует фактически у всех штаммов Helicobacter pylori. Ранее были описаны различные аллельные варианты двух вариабельных участков этого гена. Так, vacA s регион (кодирующий сигнальный пептид) существует в виде s1 или s2 аллельных типов. В s1 типе были идентифицированы s1a, s1b и s1c субтипы. Средний m регион существует в двух аллельных вариантах - m1 или m2 (J. Atheron, 1995; 1997).

Уровень секреции вакуолизирующего цитотоксина определяется мозаичной структурой гена, кодирующего VacA. Генотипы штаммов H.pylori s1m1 и s1m2 vacA имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина. Генотип штаммов H.pylori s2m2 проявляет незначительную токсическую активность (T. Cover, 1992; J. Guruge, 1998). Между cagA- и vacAs1- генотипами штаммов H.pylori существует строгая ассоциация - большинство vacAs1- штаммов являются cagA позитивными.

Относительно недавно описанный ген iceA (induced by contact with epithelium) существует в двух аллельных формах - iceA1 и iceA2. Предполагается, что iceA1 является маркером язвенной болезни желудка . У больных, инфицированных H. pylori c генотипом iceA1, инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки желудка полиморфно-ядерными нейтрофилами выше, чем у инфицированных H. Pylori с другим генотипом. В ряде работ было показано, что адгезия к эпителиальным клеткам желудка in vitro индуцируется экспрессией IceA1 белка. Однако in vivo детектируются как iceA1, так и iceA2 транскрипты (R. Peek, 1998).

Факторы бактериальной адгезии на эпителий желудка человека также могут вносить вклад в специфический тропизм и патогеность штаммов H. pylori. Ген babA (blood group antigen-binding adhesin) является медиатором адгезии H. pylori с системой антигенов Lewis (Le) на эпителиальных клетках желудка. In vitro было показано, что H.pylori специфически связывается с поверхностью клеток слизистой желудка и регулируется фукосилированными антигенами этой группы. Более того, эксперименты на трансгенных мышах, экспрессиру-ющих Lewis В эпитоп в эпителиальных клетках желудка, показали, что он функционирует как рецептор для H.pylori адгезина и запускает процесс прикрепления бактерии к поверхности слизистых клеток желудка. Прикрепление H. pylori к поверхности слизистых клеток желудка у трансгенных мышей вызывает развитие хронических гастритов и атрофий (R. Falk, 1995; J. Guruge, 1998). Ген, кодирующий белок BabA, был клонирован и идентифицирован как babA2. Адгезия H.pylori, как полагают, служит для защиты бактерии от кислой среды желудка, а также от ее возможного смещения (перемещения) вследствие его перистальтики (J. Guruge, 1998).

В настоящее время не все молекулярно-биологические и клинико-диагностические лаборатории имеют возможность культивирования H.pylori. Между тем, определение факторов патогенности H.pylori, выделенных от пациентов, проживающих в различных регионах РФ, и создание генотипической карты может быть определяющим фактором в эпидемиологии и лечении H.pylori-инфекции.

Целью работы, проводившейся в научной лаборатории НПФ «ЛИТЕХ», являлось генотипирование клинических изолятов H.pylori из различных регионов РФ (Москва и Московская область, Красноярск, Уфа и Казань), а также разработка метода генотипирования штаммов H.pylori непосредственно в биопсийном материале слизистой оболочки желудка с помощью ПЦР.

Частота встречаемости vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 генотипов в биопсиях и клинических изолятах H.pylori

Клинические изоляты H.pylori и H.pylori, верифицированные непосредственно в биопсийном материале с помощью ПЦР, были проанализированы на одновременное присутствие vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 генотипов.

Исследования одновременного присутствия у клинических изолятов H.pylori генотипов vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 показали, что при babA2 положительном генотипе H.pylori 12 из 15 изолятов имели vacAs1 генотип (P=0.385), iceA1 положительный генотип имели 14 клинических изолятов H.pylori (P=0.489). При исследованиях биопсийного материала были получены следующие результаты: vacAs1 генотип H.pylori был верифицирован в 31 случае (˜2=4.789, P=0.028), cagA встречался в 34 случаях (˜2=4.134, P=0.042) и iceA1 генотип в 28 случаях (P=0.207).

В клинических изолятах H.pylori распределение генов патогенности было следующим: тип 1 (vacAs1, cagA и babA2) - 50%, тип 2 (vacAs1, cagA, iceA1 и babA2) –46%. При исследовании биопсийного материала, верифицированного на наличие H.pylori, было обнаружено следующее сочетание генов: vacAs1, cagA и babA2 (тип 1) - 36% случаев, а vacAs1, cagA, iceA1 и babA2 (тип2) - 30%.

Значительных отличий между типами H.pylori 1 и 2 при изучении биопсийного материала и между клиническими изолятами H.pylori не наблюдалось. Но при сравнении клинических изолятов H.pylori и H.pylori, верифицированных в биопсийном материале, разброс в распределении типов 1 и 2 H.pylori был достаточно велик (до 20%).

Распределение генотипов H.pylori в биопсиях при различных заболеваниях желудка

Результаты генотипирования H.pylori при ЯБДК и хроническом гастродуодените приведены в Таблице. CagA генотип H.pylori встречался в биопсийном материале, полученном от пациентов как с ЯБДК, так и с хроническим гастродуоденитом (относительное содержание оценивалось только для значимых выборок). Так cagA генотип H.pylori был верифицирован в 92% случаев у пациентов с ЯБДК и в 94% случаев у пациентов с хроническим гастродуоденитом. Однако ˜2 – тест, также как и тест Фишера не выявил каких-либо предпочтительных ассоциаций между cagA и конкретным заболеванием.

Частота встречаемости генотипа H.pylori vacAs1 при ЯБДК и хроническом гастродуодените также не носит значимого характера. Нам не удалось зарегистрировать каких-либо строгих ассоциаций между vacAs1, vacAm1, iceA1 и babA2 генотипами H.pylori и ЯБДК и хроническим гастродуоденитом. Исходя из данных, представленных в Таблице, можно предполагать, что распределение генотипов H.pylori при ЯБДК и хроническим гастродуодените носит скорее всего случайный характер.

Окончательно вопрос о необходимости генотипирования H.pylori в биопсиях возможно решить только после изучения биопсийного материала, полученного от пациентов с хроническим гастритом, ЯБЖ, экстранодальной В-клеточной MALT-лимфомой или аденокарциномой желудка.

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в Москве и Московской области

В Москве и Московской области VacAs1 генотип H.pylori был верифицирован в 63% случаев при изучении биопсийного материала и в 77% случаев при изучении клинических изолятов H.pylori. 18 штаммов H.pylori, верифицированных в биопсийном материале, и 2 клинических изолята H.pylori имели генотип vacAs2. Интересно, что штаммы H.pylori, имеющие смешанный генотип vacA (s1/s2 или m1/m2), указывающий на присутствие более чем одного штамма Helicobacter pylori, были верифицированы в биопсийном материале в 44 (50%) случаях и в 4-х клинических изолятах H.pylori (30%).

При исследовании биопсийного материала в 81 (93%) случае нами был зарегистрирован маркер островка патогенности H.pylori, который в 100% случаев присутствовал и в клинических изолятах H.pylori. К сожалению, нам не удалось выявить, как отдельный, iceA2 генотип ни в биопсийном материале, ни в клинических изолятах. IceA2 генотип выявлялся только в сочетании с iceA1 генотипом в 18 (21%) образцах биопсий и в 5 (38%) клинических изолятах H.pylori. IceA1 генотип был зафиксирован в 52 образцах биопсий и 6 клинических изолятах H.pylori. IceA генотип не был выявлен в 17 (20%) биопсий и у 2 (15%) клинических изолятов H.pylori. BabA2 ген верифицирован у H.pylori при исследовании биопсийного материала в 34 (39%) случаях. Этот же ген присутствовал в 8 (62%) клинических изолятах H.pylori.

Нами также были выявлены комбинации vacA s- и m- регионов, cagA, iceA и babA2 генотипов H.pylori. Из 18 возможных генотипов H.pylori vacS1, cagA, iceA1 и babA2 генотип встречался в 31% случаев у H.pylori верифицированного в биопсийном материале, и у 54% клинических изолятов H.pylori. Ни одного образца с генотипом vacAs2/m1 нами найдено не было. Неслучайный характер распределения комбинаций генотипов подтверждается ассоциацией отдельных, индивидуальных генотипов cagA, vacA, iceA и babA. СagA положительные H.pylori в биопсиях и клинических изолятах чаще всего имели vacAs1 (p<0.001) и iceA1 (p<0.001) генотипы.

Как видно из данных, представленных в Таблице результаты генотипирования генов патогенности у H.pylori, верифицированного в биопсийном материале и в клинических изолятах, значительно различаются, особенно для vacAm1, babA2 генотипов.

Тем не менее, на имеющемся биологическом материале (биопсии, клинические изоляты) возможно оценить достоверность результатов, полученных при генотипировании H.pylori в биопсиях по отношению к клиническим изолятам (стандарт генотипирования). Так для vacA, cagA и iceA ошибка определения генотипа в биопсиях по сравнению с культурами составляет 10-15%, а для babA2 20-25%. Результаты генотипирования в биопсиях несколько занижены по отношению к культурам, что вероятно связано с сохранностью ДНК H.pylori (некоторая часть ПЦР анализа ДНК из биопсий производилась ретроспективно).

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в различных регионах Российской Федерации

Анализ клинических изолятов из Москвы и Московской области (n=13), Красноярска (n=3), Уфы (n=3) и Казани (n=5) показал, что распределение cagA положительного генотипа H.pylori не зависит от регионального распределения, поскольку CagA генотип был выявлен во всех клинических изолятах. VacAs1 генотип H.pylori был выявлен в 33% клинических изолятов из Красноярска и в 100% клинических изолятов из Уфы. Приблизительно одинаковое распределение vacAs1 гнотипа H.pylori встречается в Москве - 77% случаев и в Казани - 60% случаев. Интересно, что распределение vacAm1 генотипа H.pylori не имеет региональной специфичности и встречается в 20% клинических изолятов из Казани и в 33% клинических изолятов из Уфы. Нам не удалось выявить смешанных генотипов H.pylori в Уфе, в то время как в Красноярске 33% клинических изолятов соответствовали vacAs1/s2 генотипу. 31-33% клинических изолятов из Москвы и Уфы и 60-67% из Казани и Красноярска соответствовали vacAm1/m2 генотипу. IceA2 генотип был выявлен только в сочетании с iceA1 генотипом (38% клинических изолятов из Москвы и 60% из Казани). Среди клинических изолятов из Красноярска и Уфы данный генотип вообще не встречался. В клинических изолятах из Уфы и Красноярска в 100% случаев присутствовал iceA1 генотип. Этот же генотип в клинических изолятах из Москвы и Казани встречался в 46% и 40% случаев, соответственно. Значительно варьировало распределение babA2 положительного генотипа у клинических изолятов из различных регионов РФ. Так babA2 генотип встречался в 33% клинических изолятов из Уфы и в 100% клинических изолятов из Красноярска. Необходимо также отметить, что распределение babA2 генотипа по регионам РФ имеет ассиметричный характер по отношению к vacAs1 генотипу. Так, если в Красноярске и Уфе vacAs1 генотип встречался в 33% и 100% случаев, то babA2 генотип в 100% и 33%, соответственно. Суммируя приведенные выше результаты, можно предполагать, что распределение генотипов H.pylori в различных регионах РФ носит, скорее всего, не случайный характер.

Частота встречаемости и корреляция в vacA s1, cagA, babA и iceA1 в биопсиях и изолятах H.pylori

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori по регионам России

Распределение генотипов cagA, vacA, iceA и babA2 H.pylori в Москве и Московской области

Тип 1 – сочетание vacA s1, cagA, babA, тип 2 - vacA s1, cagA, babA, iceA1

Распределение генотипов H.pylori при различных заболеваниях желудка

Тип 1 – сочетание vacA s1, cagA, babA, тип 2 - vacA s1, cagA, babA, iceA1

Таким образом, важность представлений о распределении генотипов H.pylori при различных заболеваниях может быть обусловлена следующими фактами: штаммы СagA оказывают более значимое воздействие на прогноз заболевания, чем штаммы без СagA (M. Blaser, 1995; T. Cover, 1995; 1996); штаммы с типом s1VacA чаще ассоциированы с заболеваниями желудка, чем штаммы s2VacA (J. Ateron,1997); BabA2 штаммы H.pylori строго связаны с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (Р=0.0002) и аденокарциномой (Р=0.033) в отличии от VacAs1 и CagA штаммов, которые ассоциированы только с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (Р=0.004); и наконец, эффективность лечения также во многом зависит от генотипа H.pylori (L. . VanDoorn, 1997).

Данные о распределении генотипов H.pylori в различных регионах РФ во многом могут облегчить диагностику H.pylori-ассоциированных заболеваний в определенных географических районах. В нашей работе мы впервые попытались охарактеризовать распределение генотипов H.pylori в РФ, а также выявить возможность их ПЦР-анализа непосредственно из биопсий.

Географическое распределение генотипов клинических изолятов H.pylori обычно оценивают на основе анализа s и m локусов VacA. Для клинических изолятов H.pylori характерны два основных типа s-региона - s1 и s2, которые различаются как по размеру, так и по аминокислотной последовательности. Их высокая консервативность подтверждена работами T. Athreton и соавторами (1995), который изучал распределение генотипов в США. В настоящее время идентифицированы 3 субтипа: s1a, s1b и s1c.

В нашей работе показано, что наиболее часто генотип vacAs1 встречается в центральном регионе РФ – до 100% клинических изолятов H.pylori. Распределение vacAm1 достаточно равномерно по всем регионам и варьирует от 20% в Казани до 33% в Красноярске и Уфе. Наиболее распространенный генотип H.pylori в РФ vacA s1/m1.

Геном H.pylori содержит только одну копию гена vacA, поэтому регистрация смешанных генотипов свидетельствует о присутствии более чем одного штамма в клиническом образце. Нами была определена очень высокая доля смешанных генотипов H.pylori по vacA гену: 50% в биопсиях и 30-40% в клинических изолятах. В Голландии и Португалии доля смешанных генотипов H.pylori составляет 8 и 29%, соответственно. Этот феномен, вероятно, можно соотнести с уровнем инфицирования населения H.pylori. Так, в Португалии уровень инфицирования H.pylori взрослого населения составляет приблизительно 80%, в то время как в Голландии инфицировано всего 30% населения. В России 90%, а в некоторых регионах и 100% взрослого населения инфицированы H.pylori ( L. VanDoorn, 1998). Таким образом, риск коинфекции или суперинфекции смешанными штаммами может быть выше в странах с высоким уровнем инфицирования населения H.pylori по сравнению со странами с низким уровнем инфицирования. С другой стороны, до сих пор неизвестно, может ли инфекция смешанной культурой H.pylori увеличить риск серьезных клинических проявлений, таких как язва или рак желудка, также остается открытым вопрос о подходе к лечению таких пациентов.

Никакой специфичности распределения cagA гена по регионам РФ нами не обнаружено. Все проанализированные нами изоляты H.pylori, полученные из регионов РФ, содержали cagA ген (100%). Полученные данные значительно отличаются от распределения cagA в Северной и Восточной Европе – 71%, но сопоставимы с результатами, полученными во Франции и Португалии – 95 и 100%, соответственно.

Генотип iceA1 является маркером язвенной болезни желудка. Распределение генотипа iceA1 H.pylori в регионах РФ имеет большую географическую специфичность. Так, в Москве 46% клинических изолятов имели генотип iceA1, в Казани – 40% и 100% в Красноярске и Уфе. Интересно отметить достаточно большую разницу в частоте встречаемости генотипа iceA1 H.pylori между двумя соседними городами Казанью и Уфой и абсолютно полное совпадение частоты выявляемости этого генотипа в Красноярске и Уфе. Следует также отметить, что нами был зарегистрирован только генотип iceA1 H.pylori и ни одного клинического изолята с генотипом iceA2.

Нами также была отмечена неравномерность присутствия babA2 гена у H.pylori в различных регионах РФ. В Уфе babA2 ген был выявлен в 33% клинических изолятов, а в Красноярске в 100%. В работах Gerhard (для немецкой популяции) было продемонстрировано, что содержание babA2 гена строго ассоциировано с заболеваниями желудка. Так, этот ген присутствует у 51% штаммов H.pylori, выделенных от пациентов с гастритом, у 70% штаммов, выделенных от пациентов с MALT-лимфомой, у 78% штаммов, выделенных от пациентов с аденокарциномой, и у 100% штаммов, выделенных от пациентов с ЯБДК. Данный ген был предложен авторами в качестве маркера ЯБДК и аденокарциномы. Результаты нашей работы не выявили какой-либо ассоциации между babA2 геном и заболеваниями желудка. Более того, нам не удалось выявить статистически значимых корреляций между babA2 и другими генами патогенности в клинических изолятах и биопсиях.

Как уже отмечалось выше, расхождение результатов при генотипировании методом ПЦР H.pylori, выделенной из биопсии и изолятов составляет от 23% для babA2 и до 7% для cagA. Данное расхождение в полученных нами результатах, может быть объяснено, тем, что генотипирование H.pylori проводилось на архивном материале. Возможно, что для оценки каких-либо ассоциаций между генами патогенности, также как и связи между различными генотипами и заболеваниями желудка необходимо накопить большее количество наблюдений, чем в нашем исследовании. Но с другой стороны, очевидно, что существующие в настоящее время методы определения факторов патогенности и вирулентности H.pylori не позволяют однозначно прогнозировать исход и развитие заболевания, вызываемым этим патогеном. Вероятно, что необходимо изучать взаимодействие и взаимоотношение микроба и хозяина, как динамический процесс. В настоящее время, нами предпринимаются попытки выработать алгоритм характеристики этих взаимоотношений на основе современных методов молекулярной биологии – геномики, протеомики и транскриптомики. Cочетание этих методов позволит выявить реальное воздействие факторов патогенности и вирулентности H.pylori на хозяина, а также давать прогноз заболеваний.