Лабораторная диагностика трихомонадной инфекции

Диагностика урогенитального трихомониаза основывается на выявлении клинических признаков заболевания и обнаружении в исследуемом материале T.vaginalis.

Другие человеческие трихомонады, наблюдаемые при лабораторной диагностике, в основном, следует рассматривать как контаминациию во время забора материала. Такие ошибки в диагностике трихомониаза чаще случаются при обследовании детей. Однако в связи с изменением стереотипов сексуального поведения в последнее время (промискуитет, увеличение частоты орально-генитальных и анально-генитальных контактов) необходимо учитывать возможность определения в урогенитальном тракте больных трихомониазом других видов трихомонад - Trichomonas tenax (elongata), Trichomonas hominis (abdominalis). Например, отечественными авторами при электронно-микроскопическом исследовании материала прямой кишки при мочеполовом трихомониазе были обнаружены T.vaginalis, что подтверждает возможность смены простейшими привычной среды обитания и колонизации новой экологической ниши [10].

Диагностика трихомониаза основывается на классических симптомах, включающих жёлтозелёные пенистые выделения, зуд, дизурию, диспарению и "клубничный" вид шейки матки и вагины, представляющий собой точечные геморрагии. Тем не менее, диагноз не может быть поставлен исключительно на основании клинической картины по нескольким причинам:

• указанные клинические симптомы могут быть проявлениями других урогенитальных инфекций;
• классический и патогномоничный для трихомониаза "клубничный" симптом встречается только у 2% пациенток;
• пенистые выделения, которые можно связать с активным ростом трихомонад, наблюдаются примерно у 12% инфицированных женщин.

Ещё в 1980 году Фатс и Краус представили данные, свидетельствующие о том, что если диагноз трихомониаза ставился только на основании одной клиники, то у 88% инфицированных T.vaginalis женщин заболевание не было обнаружено, а у 29% неинфицированных женщин диагноз трихомонадное носительство был выставлен ошибочно [37].

В связи с тем, что клинические симптомы довольно часто не отражают реальной картины заболевания, в обязательном порядке необходимо применение лабораторных методов диагностики.

В настоящее время в России и за рубежом применяют четыре лабораторных метода определения Trichomonas vaginalis: микроскопический, культуральный, иммунологический и генодиагностический.

Микроскопический метод включает две методики. Первая - это определение трихомонад в нативном препарате при фазовом контрастировании. Необходимо найти овальное или грушевидное тело, чуть больше лейкоцита, имеющее жгутики и совершающее характерные толчкообразные поступательные движения. Такое исследование следует делать практически "не отходя от пациента", иначе в течение нескольких минут влагалищная трихомонада может прекратить свои движения. Вторая методика - это окрашивание препарата метиленовым синим (как вариант: раствором бриллиантовой зелени) или по Граму. Ведётся поиск известной формы трихомонады с правильно очерченным асимметричным ядром на фоне нежно ячеистой структуры цитоплазмы. Для выявления жгутиков и ундулирующей мембраны препарат следует окрашивать по Романовскому-Гимзе.

Чувствительность метода микроскопии по данным литературы варьирует от 38% до 82%. Несмотря на то, что этот метод среди диагностических тестов является определённо экономически наиболее целесообразным и простым, он имеет низкую чувствительность и специфичность. Это может быть обусловлено, в первую очередь, потерей трихомонадами характерной подвижности после того, как простейшее уже извлечено из среды человеческого организма. Особенно большая доля субъективизма проявляется в случае препаратов с низким титром или препаратов, содержащих огромное количество клеток эпителия, лейкоцитов и различного деструктивного материала из очага поражения. В очаге поражения влагалищная трихомонада часто представлена округлыми формами, напоминающими полиморфоядерные лейкоциты, и естественно, типичные морфологические признаки теряются во время фиксации и окрашивания, создавая трудность для этиологической идентификации.

Метод выращивания трихомонад в бульонной культуре - "золотой стандарт" для диагностики, потому что это простой в интерпретации метод и требует менее чем 300-500 трихомонад/мл инокулюма для начала роста в культуре. Тем не менее, для него существуют ограничения, присущие культуральным методам. Для диагностики необходим инкубационный период от 5 до 7 дней, являющийся слишком длительным из-за возможности инфицированного пациента к распространению инфекцию. В связи с этим он не получил широкого применения в клинической практике в качестве прямого диагностического метода.

Для улучшения восприятия культурального метода, за рубежом был разработан метод пластикового конверта, с помощью которого можно выполнить как немедленную проверку присутствия трихомонады, так и сохранить дальнейший рост трихомонад в одной самоподдерживающейся системе. Полученные результаты сравнимы с таковыми при исследовании мазка и культур. Аналогично пластиковому конверту используется система InPouch в виде двухкамерного мешка, позволяющая выполнить быструю проверку культуры путём микроскопии через стенку мешка.

Технология роста патогена на клеточной культуре использует свойства клеточных линий восстанавливать рост T.vaginalis из клинических образцов. Было продемонстрировано, что этот метод даёт лучшие результаты- относительно культивирования в бульоне и приготовления влажной камеры, поскольку способен определять T.vaginalis в концентрациях менее 3 организмов в 1 мл. Однако культивирование в культуре - это не простой рутинный метод; он дорог и неудобен для быстрой диагностики.

В России культуральный метод широко используется в лабораторной диагностике трихомониаза. Проведенный в 1990 г. анализ качества диагностики трихомониаза в ЦНИКВИ МЗ РФ, показал, что подавляющее число больных трихомониазом (72,8%) как среди женщин, так и среди мужчин были выявлены при использовании именно культурального метода [4]. Из отчественных стандартных сред, не уступающих по качеству зарубежной среде Джонсона-Трасселя, можно рекомендовать в практическое здравоохранение среду, изготавливаемую по инструкции ЦНИКВИ МЗ РФ: в 1л дистиллированной воды вносится белковый порошок 12,5г (ТУ 64-3-204-84, получаемый из отхода при производстве лизоцима), хлорид калия 0,1г, хлорид кальция 0,1г , двууглекислый натрий 0,1г , аскорбиновая кислота 0,6г , лимонная кислота 0,12г , оротоновая кислота 0,075г, лактат кальция 1,0г , мальтоза 10,0г. Смесь стерилизуется при 0,5 атмосферы в течение 30 мин в атмосфере текучего пара. После охлаждения стерильно вносится 220 мл лошадиной сыворотки и антибиотики (из расчёта 1000 Ед/мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 40 Ед/мл амфоглюкамина или 4000 Ед/мл линкомицина).

Ограничения культуральных и микроскопических методов для выявления T.vaginalis заставили учёных развивать альтернативные методы, которые могут определять антиген, антитело или нуклеиновые кислоты в уретральном или вагинальном экссудате. Иммунологические методы не получили должного распространения в России из-за отсутствия качественных отечественных наборов реагентов. Вследствие этого мы можем ссылаться на опыт зарубежных авторов [24].

Существует восемь известных серотипов T.vaginalis. Однако иммуноблот показывает широкое варьирование антигенных маркёров. Используются различные методы определения антитрихомонадных антител: агглютинация, фиксация комплемента, непрямая гемаглютинация, диффузия в геле, флюоресценция антител и иммуноферментный анализ. Однако сыворотка или местный иммунный ответ на патоген зависит от нескольких факторов: характер субстанции антигена или патогена, его живой или убитой форм, концентрации, частоты и длительности стимуляции иммунной системы. Всё это обуславливает работе таких систем ряд недостатков. В некоторых случаях иммунный ответ не наблюдается потому, что система либо слишком мало чувствительна для выявления низкого уровня специфических антител, либо потому что не был вызван гуморальный ответ. Поскольку антитрихомонадные антитела могут циркулировать в сыворотке крови в течение длительного времени после лечения, то практически невозможно дифференцировать текущую и пролеченную формы инфекции.

Определённое клиническое значение имеет прямое определение специфических белков T.vaginalis в биопробах с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомониаза. Моноклональные антитела для выявления T.vaginalis из клинических образцов давали аналогичные результаты с влажными препаратами для микроскопии. Более того, использование моноклональных антител к белкам, таким как КРФ и цистеиновая протеаза, являющихся иммуногенами всех наблюдавшихся изолятов T.vaginalis, могло бы обеспечить альтернативный метод определения влагалищной трихомонады.

Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ мазков вагинального соскоба, например, коммерческий метод фирмы California Integrated Diagnostics, Benicia, Calif., использующий перокидазо- и флюорохром- меченные смеси моноклональных антител к различным структурам T.vaginalis был таким же чувствительным и специфическим, как и используемый культуральный метод. К тому же результаты определения возбудителя трихомониаза данным методом достигаются в течение одного часа, что позволяет осуществлять контрольно-диагностическую функции.

С начала 90-х годов в лабораторную клиническую практику стали внедрятся технологии определения видоспецифических нуклеотидных последовательностей областей ДНК (мишеней) геномов вирусов, бактерий и клеток высших организмов. Сначала это была ДНК-гибридизационная технология. Например, в коммерческой тест-системе Affirm VP (Micro Prob Corp, Bothwell, Wash.) используются синтетические зонды для выявления как Gardnerella vaginalis, так и T.vaginalis из одного вагинального соскоба. Данная методика лучше, чем метод влажной камеры. Тем не менее, встречались ложноотрицательные результаты при её сравнении с культуральным методом (80% чувствительности относительно положительных образцаов в культуре).

Одна из гибридизационных методик - "дот-блот" гибридизация, в которой использовался фрагмент 2,3 т.п.о. ДНК T.vaginalis в качестве зонда, могла определить ДНК T.vaginalis в вагинальном эксудате. Однако нестабильность зонда, выполнение специфических технических приёмов, особенно использование радиоактивной метки являлись большими недостатками этой методики. После того как радиоактивномеченный зонд заменили на флюоресцентно-меченный ДНК-зонд, эта методика сразу нашла своё применение при выявлении бессимптомного носительства T. vaginalis.

Новая генодиагностическая технология - "ПЦР-технология" в последнее время опережает остальные методы генодиагностики трихомониаза и наравне с культуральным методом широко используется в клинической практике. Ниже приводится более подробный материал исследований зарубежных авторов.

Лин П.Р. с соавт. [32] в 1997 году предложили одностадийную "нестед"-ПЦР методику определения ДНК T. vaginalis из отделяемого вагины. Они определяли последовательность мишени в семействе повторов длиной 650 пар оснований. Перекрёстной реакции не отмечалось с ДНК человека и таких патогенов как Pentatrichomonas hominis и Giargia lamblia. Диагностический процесс занимал 6 часов. Из 165 клинических образцов, исследованных с помощью ПЦР, культуральным методом и микроскопией влажного препарата, 16 оказались положительными на наличие T. vaginalis по данным ПЦР и росту в культуре. Микроскопия выявила только 9 положительных образцов из 16. Ни один из ПЦР-отрицательных образцов не был положительным в других методиках. Интересно, что впоследствии эти авторы дополнили свою методику калориметрической детекцией специфических ампликонов вместо электрофореза, что помогло при исследовании образцов от 113 пациентов с отсутствием клинических симптомов выявить 9 случаев инфицирования T. vaginalis, не выявлявшихся другими мeтодиками.

Мадико с соавт.[33] в 1998 г. разработали ПЦР - тест, определяющий консервативную часть гена бета-тубулина влагалищной трихомонады. Эта последовательность амплифицировалась у всех 15 лабораторных штаммов T. vaginalis и не амплифицировалась у Trichomonas tenax, Trichomonas gallinea, Chlamуdia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Giargia lamblia, Chilomastix sulcatus, Dientamoeba fragilitis, Entamoeba histolytica. Из 350 мазков, взятых от женщин с вагинитом, с помощью культурального метода (среда Inpouch TV) определили 23 случая трихомониаза. Из них 22 были подтверждены методом ПЦР и только 12 случаев подтвердились при микроскопии влажного препарата. 17 случаев было ПЦР-положительных и культурально-отрицательных, среди них в дальнейшем 10 случаев подтвердилось при обследовании других областей ДНК T. vaginalis методом ПЦР. Таким образом было признано, что данный ПЦР-тест имеет чувствительность 97% и специфичность 98% в сравнении с 70% чувствительности культурального метода и 36% метода микроскопии.

Риу Дж С. с соавт. [35] в 1999 г. предложили ПЦР методику идентификации ДНК влагалищной трихомонады с праймерами для амплификации повторяющегося фрагмента TV-E650. Они сравнили свой метод с другими наиболее часто используемыми методиками диагностики трихомониаза: микроскопей влажного препарата, микроскопей Пап-приготовленного мазка (метод Папаниколау), культуральной, а также с клиническими данными. Они считают, что предложенный метод на 100% чувствителен и специфичен, т.к. не давал перекрёстной реакции с другими простейшими и Candida albicans. Использованная ими методика ПЦР в два раза чаще выявляла трихомонаду, чем другие сравниваемые лабораторные методики.

Проводились и другие интересные исследования по определению T. vaginalis, связанные с использованием ПЦР технологии. Так, например, японские исследователи (Окияма с соавт. [36]) сумели подтвердить правомерность постановки диагноза "трихомониаз" в 19-ти случаях у женщин и в одном случае у мужчины методом ПЦР. Эти случаи были архивированы в мазках по методу Папаниколау. Австралийские исследователи Табрези С.Н. с соавт.[34] в 1998 г. проанализировали сравнительную выявляемость Neisseria gonorrhoeae, Chlamуdia trachomatis и T. vaginalis при взятии образца мочи и с тампона методом ПЦР. Они обнаружили, что ПЦР в случае исследования тампона одинаково часто выявляет хламидии, но в 2 раза чаще гонококки и трихомонады. Причём в дальнейших исследованиях они подтвердили эти данные и показали, что наиболее распространённая клиническая методика выявления трихомонад - микроскопия Пап-приготовленного мазка, принятая у них в клинической лаборатории, давала 59% положительных ответов относительно ПЦР при взятии образца тампоном.

В настоящее время в России отдельные медицинские центры начинают применять в лабораторной практике генодиагностику, ПЦР технологию, при постановке диагноза "трихомониаз".