Гедодиагностика гепатита C

Ведущую позицию в лабораторной диагностике инфекции HCV занимают методы генодиагностики, позволяя: непосредственно выявить генетический материал вируса в сыворотке крови и тканях человеческого организма (мононуклеарах, гепатоцитах, ткани костного мозга и т.д.); оценить репликативную активность вируса в тканях; количественно определить концентрацию вируса в сыворотке крови; установить генотип вируса и вести наблюдение за изменчивостью HCV.

Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является “золотым стандартом” диагностики, свидетельствующем о продолжающейся репликации HCV. По рекомендации ВОЗ установление диагноза гепатита С возможно на основании троекратного обнаружения HCV-РНК в сыворотке крови больного при отсутствии других маркеров гепатита. В острую фазу РНК вируса гепатита C выявляется в крови уже через 1-2 недели после заражения, т.е. задолго до появления анти-HCV.

При всей неоднородности популяции HCV, все генетические варианты вируса имеют консервативный участок в 5’-нетранслируемой области генома, на обнаружении, которого основаны большинство известных диагностических тест-систем для выявления РНК HCV. До недавнего времени самым чувствительным тестом при определении РНК HCV считался тест Amplicor HCV фирмы “Roche”, позволяющий выявлять 700 копий РНК в 1 мл. С помощью нового набора Abbott LCx можно определять 200 копий РНК/мл. Менее чувствительным, но широко распространенным в настоящее время является тест bDNA Quantiplex (фирма “Chiron”).

Отечественные тест-системы основаны на определении РНК HCV в клиническом образце методом RT-PCR c использованием в качестве мишени амплификации консервативной 5’ нетранслируемой области вирусного генома (НПФ “Литех”, НПФ “ДНК-технология”).

Проведение ПЦР позволяет выявить РНК HCV не только в сыворотке крове, но и в ткани печени, что важно в подтверждении роли HCV в формировании гепатоцеллюлярной карциномы. У данной категории больных РНК HCV регистрируется в гепатоцитах и при отсутствии анти-HCV и HCV-РНК в сыворотке крови.

Отличительной особенностью течения инфекции HCV является развитие многочисленных внепеченочных проявлений, что требует наблюдения за распространением вируса в организме. Методом ПЦР РНК HCV определяется в мононуклеарах крови, криопреципитатах, ткани клеточного мозга, биопсии печени и мышечной ткани.

Существует методологический подход, позволяющий не просто определять наличие вируса в ткани, но и оценивать его репликативную активность – реакция на (-) цепь РНК.

При наблюдении за больными ХГ С существенную роль играют количественная оценка содержания вируса в сыворотке или плазме крови больного и определение генотипа HCV. Наиболее благоприятный ответ на противовирусное лечение наблюдается у лиц с низким уровнем виремии и генотипом 2 или 3.

В основе известных диагностических тест-систем количественной оценки содержания HCV лежит подход, основанный на принципе конкурентной амплификации РНК HCV и внутреннего стандарта. В первую очередь это диагностикумы “Amplicor HCV monitor kit” фирмы “Roche” и “NASBA HCV” (“Organon”). Количественные тест-системы фирмы “Chiron” bDNA Quantiplex, которые позволяют непосредственно оценить концентрацию матрицы в образце по интенсивности регистрируемого сигнала. Эти тест-системы отличаются надежностью, лучшей воспроизводимостью, но более низким уровнем чувствительности, по сравнению с амплификационными. Сотрудниками фирм Gen-Probe и Bayer Diagnostics опубликованы результаты количественного определения РНК HCV методом TMA (transcription-mediated amplification) с очень низким порогом чувствительности - 50 eq/ml.

Большинство отечественных лабораторий для оценки концентрации РНК HCV используют метод предельных разведений. В основе его лежит раститровка анализируемой матрицы до исчезающих концентраций и вычисление исходной концентрации на основании результатов амплификации в сравнении с калибровочной кривой. К сожалению, этот метод не достаточно точен, так как не учитывает возможность подавления реакции амплификации в пробирке с исследуемым образцом. Тем не менее, метод достаточно прост в исполнении и до сих пор используется в ряде лабораторий для “внутреннего пользования” (in house).

В клинико-диагностической лаборатории ООО НПФ “Литех” используется полуавтоматическая система регистрации продуктов амплификации путем прямой твердофазной гибридизации с флуоресцеинмеченым зондом. Использование высокочувствительного флуориметра фирмы “Labsystems” Fluoroskan Ascent позволяет проводить детекцию связавшегося со специфической матрицей зонда непосредственно после стадии гибридизации. Интенсивность сигнала в этом случае отражает концентрацию ампликона в анализируемой пробе. Подобранная система “гнездной” амплификации позволяет максимально эффективно дискриминировать образцы с различной концентрацией РНК ВГС в клинически значимом диапазоне низко- (менее 30000 eq/ml) средне- (от 30000 до 100000 eq/ml) и высокотитражных (более 100000 eq/ml) сывороток.

Вопрос об информативности количественной оценки вирусной нагрузки при мониторинге HCV инфекции остается дискутабельным. Примерно равное число клинических школ придерживаются диаметрально противоположных точек зрения на вопрос о необходимости количественного мониторинга при HCV-инфекции. Известны исследования, демонструющие достоверную корреляцию уровня виремии пациента с уровнем тканевых трансаминаз и тяжестью течения заболевания (1994-1998 гг). В более поздних работах (2000-2001 гг) существование зависимости между концентрацией и гистологической активностью вируса отвергается. Многочисленные эпидемиологические исследования, проведенные в Америке, Японии, странах Западной Европы и Африки, показали, что концентрация НСV РНК в сыворотке крови HCV-инфицированных пациентов не постоянна. Всех обследованных можно условно разделить на три подгруппы по степени флюктуации уровня виремии.

Наиболее многочисленную группу (71,2%) составляют пациенты “постоянного” типа, у которых соотношение максимальной и минимальной концентрации HCV РНК, регистрируемых в ходе мониторинга, не превышает 5, 21,7% - “слабоменяющийся” тип с соотношением максимума и минимума от 5 до 10 и 7,1% - “сильноменяющийся” тип (макс/мин >10). Существуют данные, что уровень HCV-РНК более стабилен в группе больных с нормальным уровнем АЛТ, чем у больных с ярко выраженной биохимической активностью. Рядом исследователей обсуждается предположение, что именно “постоянный” тип уровеня виремии у пациента является хорошим прогностическим признаком эффективного ответа на интерферонотерапию. Учитывая природные колебания концентрации НСV РНК, следует отметить низкую информативность единичного определения титра НСV. Более того, сомнительными оказываются и данные мониторинга на фоне интерферонотерапии. Тем не менее, большинство авторов сходится на том, что пациенты, исходно, при первичном обследовании, имеющие низкий уровень виремии (менее 30000 eq/ml (или 5 МЕ/ml)) имеют больше шансов на успех при последующей интерферонотерапии.

Более достоверным прогностическим фактором развития HCV инфекции и ответа на противовирусную терапию является генотип ВГС. Достоверно показано, что пациенты, инфицированные 1ым типом вируса более толерантны к интерферонотерапии, чем все другие генотипы. По данным профессора Esterban (Испания) процент стойкой ремиссии на проводимую комплексную терапию PEG-интроном и рибавирином составил в группе пациентов с 1 типом вируса 42% и 82% в группе с типами 2 или 3. Более того, генотипом вируса определяется и продолжительность курса лечения, что весьма актуально, учитывая широкий спектр побочных действий интерферона и низкую переносимость этого препарата больными.

Существенной особенностью характеристики HCV является его генетическая неоднородность, соответствующая особенно быстрой замещаемости нуклеотидов. В результате образуется большое число разных генотипов и субтипов. По классификации Simmonds разграничивают 11 типов (генотипы 1-11), в свою очередь подразделяющихся на 70 подтипов (например, подтипы 1а, 1в, 1с) HCV. Особенно много субтипов HCV регистрируется в Африке и Юго-Восточной Азии. Это косвенно подтверждает существование HCV в этих регионах уже в течение нескольких столетий. Допускают, что в Европе и Северной Америке HCV появился позже, чему и соответствует существенно меньшее число субтипов. Для клинической практики достаточно разграничивать 5 субтипов HCV: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a. Установлены географические различия в распространении разных генотипов. Так, в Японии, на Тайване, частично в Китае, регистрируются преимущественно генотипы 1b, 2a, 2b. Тип 1b даже называют “японским”. В США преобладает 1a - “американский” генотип. В Европейских странах преобладает г’e5нотип HCV 1a, в Южной Европе заметно возрастает доля генотипа 1b. На территории Российской Федерации преобладающим генотипом является 1b, далее с убывающей частотой - 3a, 1a, 2a .

Обычным методологическим подходом для типирования HCV является обнаружение характерных генетических изменений (мутаций) в консервативных областях вирусного генома – 5’ нетранслируемой, Кор, NS5A областях. Типирование HCV представляет собой амплификацию консервативных областей вирусного генома и анализ специфичных нуклеотидных последовательностей методами:

1. прямого секвенирования амплифицированных фрагментов
2. последующей ПЦР с типоспецифичными праймерами
3. RFLP (анализ амплифицированных фрагментов с помощью ферментов рестрикции)
4. обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (LiPA)
5. SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК)

Для установления генотипа HCV создана коммерческая тест-система InnoLiPA HCV (“Innogenetics”), в основе которой лежит принцип обратной гибридизации с типоспецифичными зондами.

В ряде крупных диагностических центров типирование HCV проводят по оригинальным методикам, используя ПЦР с типоспецифичными праймерами, рестриктазный анализ фрагментов ДНК (RFLP), или конформационный анализ одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP).

В клинико-диагностической лаборатории ООО НПФ “Литех” создана оригинальная система генотипирования ВГС, позволяющая дискриминировать четыре основных, клинически значимых генотипа ВГС, встречающихся на территории РФ, методом аллель-специфичной амплификацией. Дизайн олигонуклеотидных праймеров позволяет выявлять характерные для определенного генотипа нуклеотидные последовательности наиболее консервативной 5’ нетранслируемой области вирусного генома. Подобраны оптимальные условия проведения аллель- специфичной амплификации, исключающие возможность перекрестной реакции между кДНК различных генотипов вируса.

Образцы:

Проведена клиническая апробация предложенного метода типирования на группе больных вирусным гепатитом С (481 пациент). Среди них HCV генотип “1в” был выявлен у 227 (47,4%) больных, “1а” – у 9 (1,8%), “2а” – у 39 (8%), “3а” – у 168 (35%), микст – у 34 (7%) и у 4 (0,8%) пациентов генотип вируса установить не удалось. Долгое время основным источником информации о распространенности различных генотипов HCV на территории РФ служили данные, полученные в Институте вирусологии им. Ивановского в 1994 году при проведении обширного мультицентрового исследования. В целом по России преобладающим был генотип 1в (70% популяции), с равной вероятностью выявлялись генотипы 1а и 3а (по 10%), у 5% обследованных был выявлен генотип 2а, 1% - микст инфекция и 4% - нетипируемые формы вируса. Эпидемиологическая картина распространенности различных генотипов HCV в Москве не отличалась от таковой по стране в целом. Данные, полученные в ООО НПФ “Литех” свидетельствуют об изменении за прошедшие 7 лет эпидемиологической ситуации среди HCV-инфицированных жителей Москвы. Достоверно снизился процент пациентов, инфицированных 1ым типом вируса (1в и 1а), при этом существенно возрасла доля пациентов, инфицированных 3а генотипом HCV и имеющих микст-инфекцию.

Важно отметить, что спектр выявляемых генотипов ВГС остался без изменений. Аналогичные тенденции прослеживаются в большинстве других странах, где проводились эпидемиологические исследования с разницей во времени от 3 до 7 лет. Изменяются процентные соотношения между различными генотипами вируса, но сохраняются географические отличия в спектре представленных генотипов, уже неоднократно описанные разными группами исследователей.

Отдельно следует оговорить приводимые проценты выявления микст инфекции. В зависимости от выбранной системы типирования частота обнаружения более одного генотипа в клиническом образце изменяется. Относительно высокий процент микст инфекций выявляется при использовании амплификационных методов типирования, в частности системы праймеров, предложенных Okamoto (до 28%), реже при использовании типоспецифичной гибридизации (тест-система “InnoLiPA HCV”) и метода ELISA. Тогда как при непосредственном секвенировании геномной РНК вируса смешанные формы инфекции обычно не удается зарегистрировать. В ходе клинической апробации разработанной системы типирования генома HCV методом аллельспецифической амплификации микст инфекция была выявлена у 7% пациентов, что сопоставимо с частотой обнаружения микст инфекции при использовании коммерческой тест системы “InnoLiPA HCV” – от 3% до 9,8% в разных исследованиях.

Кроме “территориальной” неоднородности, установлено, что популяция HCV не однородна у каждого пациента. HCV циркулирует в организме человека в виде гетерогенной смеси близкородственных мутантных штаммов, принадлежащих к одному генотипу вируса, но имеющих генетические отличия в вариабельных областях вирусного генома. Генетически отличающиеся друг от друга варианты ВГС, циркулирующие в организме одного хозяина, получили название “квазивидов”.

Исключительной нестабильностью характеризуется регион Е2/NS1, содержащий всего 80 нуклеотидов и получивший название гипервариабельного региона (НVR1). Предполагают, что именно антитела к белкам, кодируемым участком генома Е2/NS1, обладают вируснейтрализующими свойствами. Исключительная нестабильностью HVR1 региона приводит к тому, что вирусу удается изменить свою антигенную структуру, в связи с чем иммунокомпетентные клетки не в состоянии распознать непрерывно обновляющиеся антигены.

С наличием “квазивидов” связывают феномен ускользания вируса от иммунного ответа, неэффективное удаление HCV, и, как следствие, его длительное сохранение в организме человека и высокий процент хронизации инфекции. Оценку гетерогенности индивидуальной популяции HCV принято проводить на основании регистрации числа генетических вариантов HVR1 вирусного генома методами гетеродуплексного анализа или SSCP. По данным некоторых зарубежных исследователей, высокий уровень гетерогенности индивидуальной популяции HCV по HVR локусу обуславливает более тяжелое течение ХГ С с волнообразным характером колебания уровня тканевых трансаминаз и толерантностью к противовирусной терапии.

Собственные исследования, проведенные на базе НИИ Физико-химической медицины показали, что регистрация генетических изменений популяции HCV при остром гепатите С не имеет прогностической значимости, как и в ряде случаев ХГ С. Таким образом, приходится рассматривать генетическую гетерогенность как адаптивную реакцию вируса, живущего в изменяющихся условиях организма хозяина, что подтверждается различиями в субпопуляциях HCV гепатоцитов, мононуклеаров и сыворотки крови человека. Кроме того, наблюдаемая в динамике генетическая изменчивость индивидуальной популяции HCV, наряду с изменением концентрации вируса в сыворотке крови больного, может служить косвенным маркером активности репликативного процесса, происходящего в клетках печени.

Лабораторная диагностика гепатита С развивается по пути создания новых, более совершенных тест-систем. Ortho Clinic Diagnostic начала выпуск нового иммуноферментного набора для определения кор антигена в крови. Первым этапом является освобождение антигенов из клеточных структур путем лизирования сыворотки, вторым - улавливание антигенов с помощью специфических моноклональных антител. Данный тест особенно удобен при выявлении ранней стадии инфекции HCV, когда еще не появились вирус-специфические антитела. Фирмы Chiron и Gen-Probe предлагают новый амплификационный тест – NAT assay – для выявления РНК как HCV, так и HIV, способный улавливать единичные копии вируса в анализируемом материале.

В заключении следует упомянуть о необходимости комплексного обследования больного с привлечением новейших достижений медицинской и биологической науки для правильной диагностики вирусных гепатитов и назначения адекватной терапии больному.

*** "VK2023"