Методы непрямого выявления Chlamydia trachomatis

Эта группа методов позволяет, с одной стороны, избежать ложно-отрицательных результатов при прямых методах, а, с другой, - помогает в ряде случаев определить стадию и характер течения заболевания. Это особенно важно при восходящей и персистирующей инфекции, которая поддерживает хроническое течение болезни на протяжении многих месяцев и лет, и тем самым повреждает или разрушает ткани и органы. Кроме того, методы непрямого выявления бактерий особенно хороши при трудностях взятия материала для обнаружения антигена, например у детей.

В основе этих методов лежит выявление специфических антител, которые накапливаются в сыворотке крови и секретах инфицированного организма, в процессе иммунного ответа на внедрение возбудителя инфекционного заболевания. Антитела относятся к трем классам иммуноглобулиновых молекул: M, G и A. Накопление антител каждого из этих классов происходит через разные промежутки времени от начала иммунного ответа и зависит от характера инфицирования (первичное или вторичное). При первичном инфицировании сначала появляются антитела класса М, затем – G, и в последнюю очередь – А. По мере угасания иммунного ответа снижение концентрации (титра) антител каждого из классов происходит в той же последовательности. Иммунный ответ при повторном проникновении возбудителя характеризуется быстрым нарастанием титра антител классав G и А, и практически полным отсутствием антител класса М.

Таким образом, при остром инфекционном процессе у больных можно обнаружить антитела класса М или быстро нарастающие/снижающиеся количества антител классов G и А. Напротив, при хронически протекающих заболеваниях выявляются специфические антитела классов G и А, концентрации которых не изменяются на протяжении длительного времени. В ряде случаев (около 3%) при хронически протекающих заболеваниях, прежде чем образуются антитела класса G, в течение нескольких недель регистрируются невысокие титы антител класса А. У больных с бессимптомным течением заболевания определение антител класса А в постоянно низких титрах, на протяжении многих недель, говорит о наличии микробной персистенции. Низкие, неменяющиеся во времени титры специфических антител класса G указывают на давно перенесенную хламидийную инфекцию. В процессе терапии двух-трех кратное снижение количества антител классов G и А указывает на ее успешное проведение.

Для того чтобы оценить динамику изменений титров антител различных классов в клинике часто используют метод парных образцов. В соответствии с этим методом у одного и того же пациента проводят качественный и количественный анализ специфических антител с интервалом 2-3 недели.

Таблица 8 Серологическое определение стадии заболевания

При неясном результате IgA, подтверждение осуществляется определением IgM.

Таблица 9 Серологические критерии для диагностики хламидийной инфекции по результатам МИФ-теста

Таблица 10 Серологические критерии для диагностики хламидийных инфекций по результатам r-ELISA

На основании сравнения результатов при первом и втором обследовании делают заключение о характере и стадии заболевания.Таблица 10 Серологические критерии для диагностики хламидийных инфекций по результатам r-ELISA

Регистрацию специфических антител можно проводить одним из иммунологических методов. Наиболее эффективными являются методы микроиммунофлуоресценции (МИФ) и рекомбинантного липополисаха-ридного ИФА (r-ELISA), которые с одной стороны не требуют большого количества биологического материала, а с другой – позволяют достаточно точно определить к какому классу относятся антитела. На основании этих методов удалось установить серологические критерии для диагностики характера и стадии заболеваний, вызываемых хламидиями.

В России используются наборы реактивов Imx Select Хламидия (Abbott Laboratories) и Chlamydia-antigen ELISA (Medac Diagnostica).

Тест Imx Select Хламидия основан на технологии ИФА-анализа на микрочастицах (МИФА) и предназначен для качественного определения липополисахаридного антигена Clamydia trachomatis в исследуемом биологическом материале на анализаторе Imx. Поскольку этот набор содержит компоненты, полученные из человеческого материала, то при его использовании необходимо соблюдение правил биологической безопасности.

Узел пробоотборник/электрод добавляет микрочастицы в лунку, содержащую образец. Предварительно экстрагированный липолисахаридный антиген (ЛПС) образца связывается с микрочастицами. Реакционная смесь, содержащая комплексы микрочастиц с ЛПС антигеном, наносится на стекловолокнистый матрикс реакционной ячейки. Микрочастицы необратимо связываются с матриксом. К матриксу добавляются кроличьи антитела против Chlamydia trachomatis. Они связываются с ЛПС антигеном. Биотинилированные козьи антикроличьи антитела добавляются к матриксу и связываются с комплексом антихламидия/ЛПС антиген. К матриксу добавляется конъюгат щелочной фосфатазы и антител против биотина. Происходит связывание конъюгата с комплексом антиген/антитело. После удаления не связавшегося материала промыванием к матриксу добавляется субстрат 4-метилумбеллиферилфосфат. Образование флуоресцирующего продукта измеряется в оптическом узле МИФА.

Тест-система Сlamydia-Antigen-ELISA medac (регистрационное удостоверение Министерства Здравоохранения РФ № 97/128 от 07.02.97 г) является экономным и в то же время достаточно специфичным и чувствительным методом в рутинной диагностике хламидийной инфекции. В основу этого теста положен метод твердофазного ИФА-анализа. Он дает возможность определения антигенов хламидий. Твердая фаза покрыта хламидийными моноклональными антителами установленной специфичности. Амплификация достигается с использованием технологии полимерной конъюгации, в результате чего происходит фиксация, при которой на каждый связанный участок антигена приходится полимерный комплекс с высокомолекулярным фрагментом. Визуально положительные пробы окрашиваются в желто-оранжевый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена хламидии. Точный результат исследования определяют с помощью микроЭВМ, спектрофотометра “Мультискан” или другого аппарата для ИФА при длине волны 492 нм. Образцы, дающие значения поглощения выше или равные значению отсекающего поглощения (cut-off), считаются положительными. Чувствительность и специфичность ИФ методов соответственно составляет 65-70% и 90-100%.

Тест-система рELISA фирмы MEDAC DIAGNOSTICA (Германия) представляет собой иммуноферментные наборы для выявления антихламидийных антител классов IgG, IgA, IgM с определением их титра в сыворотке крови. Регистрационное удостоверение Министерства Здравоохранения РФ №97 от 7.02.97 г. Антиген для этих тест-систем получен методами генной инженерии. В качестве антигена твердой фазы используются специфические рекомбинантные липополисахаридные фрагменты хламидий, отсуствующие в липополисахаридах других бактерий. Это важно учитывать, потому что обследуемое лицо может в течение жизни подвергаться инфицированию не только Chlamydia trachomatis, но и другими хламидиями с выработкой к ним соответствующих антител. Понижение титра антител служит важнейшим показателем эффективности проводимого лечения.

C января 1999 г на российском рынке появились тест-наборы Clamydia trachomatis IgG и IgA pELISA medac. Они используют синтетический пептид из иммунодоминантной области МОМР. С помощью этого высокоспецифичного антигена возможно выделение cпецифических антител к Chlamydia trachomatis высокой cтепенью чувствительности.

Показания к выявлению антихламидийных антител классов IgG, IgA, IgM в сыворотке крови методом ИФА

1. Определение стадии заболевания:
2. Оценка эффективности проводимого лечения (наряду с исследованием культуральным методом и ПЦР)
3. Установление хламидийной этиологии экстрагенитальных поражений:

Преимущества теста:

• отсутствие ложноположительных результатов, обусловленных межвидовой перекрестной реакцией хламидий;
• отсутствие инфекционного антигенного материала;
• химически точная структура антигена;
• наличие стрипов позволяет экономично использовать тесты;
• тест пригоден для использования на автоматических открытых системах для ИФА.

ЗАО “Вектор-Бест” (Новосибирск) производит cледующие тест-системы для диагностики хламидиоза методом ИФА:

• ХламиБест-IgG-стрип для выявления иммуноглобулинов классов G к Chlamydia trachomatis и Chlamydiа psittacci в сыворотке крови;
• ХламиБест-Trachomatis IgG-стрип. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к Chlamydia trachomatis в сыворотке (плазме) крови;
• ХламиБест-IgM - стрип. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к Chlamydia trachоmatis и Chlamydia psittaci;
• ВектоХлами-антиген-стрип. Тест-система для выявления антигена Сhlamydia trachomatis. Хромоген-ОФД.
• ВектоХлами-антиген-стрип. Тест-сиcтема для выявления антигена Chlamydia trachomatis.